OsHDA703互作蛋白的筛选及其抗RSV的机制

方紫薇, 唐 冉，隆林芳，陈 艳*

(1. 北京农学院 生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京102206；2.中国科学院 微生物研究所，北京 100101)

酵母双杂交(Yeast two hybrid)是一种高效的互作蛋白筛选方法，该技术已经被广泛应用于各类生物的蛋白质互作研究[1]。由水稻条纹病毒(Rice strip virus, RSV)引起的水稻条纹叶枯病给水稻生产造成巨大损失[2]。目前RSV的分布、传播方式、致病性等，在寄主的先天免疫防御、流行病学等方面的研究也得到了进展[3]，但是寄主对病毒的抗性机制还有待研究。因此,研究RSV侵染下，水稻体内的蛋白互作，对阐明抗RSV的机制有重要的作用。

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)的功能是去除组蛋白中的乙酰基，使染色质更加紧密，从而转录因子与DNA结合的可行性降低，进而抑制转录[4]。目前，拟南芥、水稻等多种植物中的组蛋白去乙酰化酶被鉴定出来，将其分为三个亚家族，分别为RPD3/HDA1家族、Sir2家族和HD2家族[5]。目前在水稻中已报道了18个编码HDAC的基因，其中组蛋白去乙酰化酶703(简称OsHDA703)属于RPD3/HDA1型[6]，也被称为OsHDAC3。

研究表明OsHDA703调控了组蛋白H4的乙酰化水平，并参与调控种子形态和生殖发育过程[7]，而且Jang等报道OsHDA703主要在根和愈伤组织细胞中表达[8]；2020年研究还发现了OsHDA703与油菜素内酯(Brassinosteroids，BR)信号传导的下游信号分子OsBZR1互作，调控BR信号通路，影响水稻生长和抽穗期[9]。这些结果说明OsHDA703参与了水稻生长发育的调节过程。2008年，Kim等发现拟南芥中的组蛋白去乙酰化酶19(AtHDA19)分别与转录因子WRKY38和WRKY62相互作用，调控了拟南芥抗细菌的相关免疫途径[10]。作为AtHDA19在水稻中的同源蛋白，本研究期望发现OsHDA703是否也参与调控水稻抗RSV的免疫反应，并筛选其互作蛋白,旨在为OsHDA703在水稻抗病方面的生物学功能及作用机制的研究提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体、试剂和培养基

大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株Y2H Gold和Y187、水稻品种“日本晴”(OryzasativaL.Nippobare)、酵母文库(感染RSV的日本晴水稻的mRNA) ，均由中国科学院微生物所颜永胜课题组提供。

质粒pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-53、pGADT7-T、pGBKT7-Lam(TaKaRa，中国上海)购自上海欧易生物医学科技有限公司。酵母四缺陷型氨基酸混合物(Dropout Supplement)、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和组氨酸购自北京酷来搏科技有限公司；RNA反转录、重组克隆试剂盒、高保真DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；qPCR 的专用试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

SD培养基(Synthetic Dropout Medium，SD)，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPDA)，用于酵母繁殖和筛选；LB培养基用于大肠杆菌DH5α的培养。

1.2 重组诱饵载体pGBKT7- OsHDA703的构建

参照Clontech (Cat. No. 630489)方法进行酵母双杂阳性对照和阴性对照的构建。703特异性引物，703-BK-F:5’-CATATGGCCATGGAGGCCATGGACCCCTCGT CGGCGGG-3’和703-BK-R:5’-CGCTGCAGGTCGACGGATTTTGGGTGAGCTTCCCGGTT-3’。以水稻日本晴14 d苗为材料，采用Trizol法提取总RNA[11]，并参照逆转录试剂盒说明制备cDNA。并参照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase说明书，以cDNA为模板，扩增OsHDA703基因全长序列；使用BamHI和EcoRI对质粒pGBKT7进行双酶切后与扩增的OsHDA703基因全长序列进行进行重组反应，回收重组载体测序。对重组成功的质粒，转入酵母，表达OsHDA703诱饵蛋白。

1.3 诱饵蛋白的自激活性检测

将质粒pGADT7转入酵母菌株Y187中，在其特征培养基SD(-Leu)上培养；pGBKT7- OsHDA703转入酵母菌株Y2H Gold中，在其特征培养基SD(-Trp)上培养；随后，各挑取1个SD(-Leu)和SD(-Trp)长出的单菌落于500 μL 2×YPDA液体培养基中混合培养12～15 h后，将菌液全部涂布在SD(-Trp/-Leu)培养基上培养，3 d后挑取能长出的单菌落重悬于100 μL无菌水中。稀释10×或100×，分别吸取其10 μL菌液滴在SD(-Trp/-Leu)、SD(-Trp/-Leu/-His)和SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)固体培养基上培养3～5 d。结果观察，如果在SD(-Trp/-Leu/-His)和SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)培养基上没有菌落长出，说明诱饵蛋白pGBKT7- OsHDA703没有自激活的特性。

1.4 水稻cDNA酵母文库筛选

水稻cDNA酵母文库筛选方法参照Clontech(Cat. No. 630489)稍有改进。挑取表达诱饵载体的酵母Y2H Gold单菌落(直径2～3 mm)于50 mL的SD(/-Trp)液体培养基中，在30 ℃转速220 r/min过夜培养至浓度OD600为0.8后，低速离心收集沉淀；然后用5 mL SD(/-Trp)液体培养基重悬沉淀获得诱饵载体菌液(菌液浓度>1×108cfu/mL)。取1 mL酵母文库菌液与5 mL诱饵载体菌液混合，加入50 mL的2×YPDA(含50 μg/mL卡那霉素)液体培养基，于3 L三角瓶中低速摇菌(50 r/min)进行结合培养。20 h后，取少量菌液在显微镜下观察，如出现米老鼠状酵母接合体，说明酵母接合杂交成功。随后将菌液全部倒入50 mL离心管，低速离心收集沉淀。

取10 μL接合成功的酵母菌液，稀释1 000后，取200 μL分别涂布在SD(-Leu)和SD(-Leu/-Trp)固体平皿上培养3 d根据生长出的菌落数计算结合效率，结合效率=酵母菌液在SD(-Leu/-Trp)培养基上长出的菌落数/酵母菌液在SD(-Leu)培养基上能长出的菌落数×100%。杂交效率大于2%即为合格。剩余49.9 mL菌液全部均匀涂布在62个SD(-Trp/-Leu/-His)固体培养基上，每个平皿800 μL；挑取长出2～3 mm大小的单菌落重悬于10 μL无菌水中，滴在SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)培养基上培养3～5 d后挑取正常生长的菌落即为可能互作的结合子。

随后，为扩繁质粒数量，提取酵母质粒，应用热激法将酵母质粒转化大肠杆菌菌株DH5α，使用含有氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的LB培养基筛选抗Amp的菌株；使用pGADT7通用引物(T7：5’-TTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)对抗性菌株的质粒进行测序。测序结果进行互作基因的鉴定及功能预测。

1.5 互作基因鉴定及功能预测

将测序结果，在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)网站上使用Blast X功能进行序列比对，找到相近基因序列；随后在水稻基因组注释平台RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)网站上查找水稻相应基因序列、名称及功能。同时，使用Vector NTI软件筛除假阳性克隆。

1.6 RSV侵染前后互作基因的表达变化分析

使用NCBI的Primer-BLAST功能对每个酵母双杂筛选出来的互作基因进行引物设计，引物序列见表1。参照Hu等[12]的方法制备带毒水稻和不带毒水稻，采用Trizol法提取总RNA后制备cDNA。以此cDNA为模板，参照SYBR®Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit说明书，检测互作基因在水稻病毒侵染前后的表达变化。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

2 结果与分析

2.1 OsHDA703诱饵蛋白表达载体的构建及序列测定

如图1，特异引物从水稻cDNA中扩增的OsHDA703基因片段全长为1 533 bp。随后将OsHDA703片段与质粒pGBKT7进行重组，获得重组质粒pGBKT7-OsHDA703。使用特异引物HD-820F:5’-TCCTGGTGCAGTCGTGCTTCA-3’检测重组质粒，发现重组载体的前672位碱基与OsHDAC703 cDNA序列上第859～1 530位碱基完全相同，重组载体的后78位碱基与载体pGBKT7BamHI酶切位点后的78个碱基相同，说明BamHI酶切位点接口连接无误，进而表明OsHDA703已经成功构建在酵母载体上。

图1 OsHDA703基因的PCR产物Fig.1 PCR products of OsHDA703

2.2 诱饵蛋白自激活性检测

如图2，含有pGADT7酵母菌株Y187和含有pGBKT7- OsHDA703的酵母菌株Y2H Gold经混合中培养3 d后，发现在SD(-Trp/-Leu)固体培养基上有菌落长出，说明酵母接合杂交成功；而在SD(-Trp/-Leu/-His)、SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His)固体培养基上无菌落生长，说明pGBKT7-OsHDA703不具有自激活性，可以进行后续互作蛋白的筛选。

图2 诱饵蛋白自激活性检测Fig.2 Autoactivation test of bait protein

2.3 酵母文库筛选OsHDA703互作蛋白的结果

酵母文库与诱饵载体混合培养后的菌液经40倍镜检，观察到了米奇头状酵母接合体(图3A)，说明诱饵与文库中的蛋白接合杂交成功。结合后的酵母菌液在SD(-Leu)培养基上能长出约225个菌落(图3B，每个菌落2～3 mm)，而在SD(-Leu/-Trp)培养基上长出约20个单克隆菌落，杂交率为8.9%，满足酵母双杂交文库筛选所需2%的杂交效率。

注：A酵母接合体；B计算接合率的酵母培养Note: A yeast zygotes; B yeast culture for calculating mating efficiency图3 酵母接合体及接合率的计算Fig.3 Yeast zygotes and calculation of mating efficiency

在此基础上，将剩余49.9mL菌液全部均匀涂布于62个SD(-Trp/-Leu/-His)平皿上进行初次筛选(图4A)，获得长势最接近阳性对照(图4B)的单菌落1 068个。随后在SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His) 平皿上再次筛选，得到56个互作较强的酵母接合体，经测序检测后得到20个未移码的阳性克隆，14个非重复的候选基因序列，表明筛选得到14个与OsHDA703互作的蛋白。

注： A 酵母接合子初选结果；B 上排pGBKT7-53+pGADT7-T为阳性对照，下排pGBKT7-Lam+pGADT7-T为阴性对照Note: A Primary screening of yeast zygotes; B The upper row: pGBKT7-53+pGADT7-T served as positive control; the lower row： pGBKT7-Lam+pGADT7-T served as negative control图4 酵母接合子初选结果与对照Fig.4 Screening of yeast zygotes and control

经NCBI序列比对，及在Rice Genome Annotation Project网站上查找的水稻相应基因序列、名称及功能，经酵母双杂筛选出来14个与OsHDA703互作的蛋白，见表2，其中 1个为线粒体蛋白COX11(LOC_Os03g50940)、1个为翻译因子EF-Tu(LOC_Os03g08020.1)、5个为叶绿体蛋白(LOC_Os05g33510、LOC_Os06g01210、LOC_Os07g37030.1、LOC_Os02g22260.1、LOC_Os05g36000.1)、1个为转座子蛋白(LOC_Os04g55710.1)、2个为核蛋白ZF-HD和DIP1(LOC_Os12g10630、LOC_Os05g34070.1)、1个为Cupin超家族蛋白酶(LOC_Os04g36760.1)、1个为内参基因编码蛋白(LOC_Os01g64630)和2个未知功能蛋白(LOC_Os02g40260、LOC_Os11g38040)。

2.4 互作蛋白在RSV侵染水稻前后基因表达变化分析

对酵母双杂筛选出来的14个互作蛋白的基因表达分析发现(图5)，RSV侵染后，诱导OsHDA703表达量上调，1号和5号基因(基因位点见表2)亦表达上调，2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13和14号基因表达下调。说明RSV侵染诱导OsHDA703、1号和5号基因的表达，而抑制了其他基因对的表达。

表2 与OsHDA703互作蛋白的基因功能分析Tab.2 Gene function analysis of interacting protein with OsHDA703

1号蛋白推测可能是位于细胞核中的锌指蛋白，有报道认为锌指蛋白作为在真核生物细胞核中稳定存在的、拥有DNA结合结构域的蛋白，可以单独或与其他蛋白形成复合体，在转录过程中以及植物对生物和非生物胁迫的应急反应中发挥作用[13]；

而5号是转座子蛋白，定位于线粒体。之前的研究发现OsHDA703定位于细胞核[9]，但是OsHDA703是否也在其他细胞器中表达还没有研究。因此推测1号和5号蛋白都有可能与OsHDA703互作，参与植物抗RSV免疫反应。

注：A 细胞核中互作基因；B质体中互作基因和未知基因；C 线粒体中互作基因；D OsHDA703Note: A Interacting genes in nucleus; B Interacting genes in plastid genes andunknown genes; C Interacting genes in mitochondrial; D OsHDA703图5 水稻侵染前后互作基因的表达分析Fig.5 Expression analysis of interaction genes before and after RSV infection in Rice

3 讨 论

酵母双杂交这一方法在很多蛋白互作研究中被报道使用，目前国内外关于RSV和组蛋白去乙酰化酶之间的调控机制，以及蛋白互作的研究报道较少。本研究采用酵母接合型双杂交系统筛选与OsHDA703互作的蛋白，结果酵母接合效率约为8%，高于试验所要求的最低值2%。

本研究通过杂交筛选后，得到了14个可能与OsHDA703互作的蛋白，包括2个未知蛋白和12个可查询的蛋白。这12个蛋白根据分布位置分为3个细胞核蛋白、2个线粒体蛋白和7个质体蛋白。

已有研究证明本实验中筛选到的一些蛋白会参与植物免疫反应。水稻拟禾本科根结线虫在侵染水稻根部时会分泌一种效应子Mg16820，通过酵母双杂交系统筛选，及植物体内双分子荧光互补鉴定，发现其与，DIP1(3号基因)产生互作[14]；而在玉米中，干旱胁迫或脱落酸处理都会诱导DIP1参与rab17途径[15]。在棉花中发现的GhABP19蛋白，作为属于Cupin超家族的水溶性植物糖蛋白(9号基因)，会调控茉莉酸介导的信号传导，和超氧化物歧化酶活性，参与棉花抗黄萎病和枯萎病的免疫反应[16]；在柠檬中，FabA基因(8号基因)会在C16和C18脂肪酸积累中的表达，从而参与油斑病的抗性调控[17]。因此推测这些蛋白可能与OsHDA703互作，参与植物抗RSV。根据已有研究发现，本研究中筛选出的7个质体蛋白和2个线粒体蛋白中一些蛋白已经被证实了可以参与植物抗病免疫，并且OsHDA703的同源蛋白OsHDA710可以定位在细胞核及细胞质[18]，因此推测OsHDA703也可能会参与调控叶绿体、线粒体蛋白乙酰化、光合作用、电子传递、植物脂肪酸合成、植物激素水平变化等途径，最终影响水稻抗RSV。

综上所述，本研究利用酵母双杂交系统筛选出14个可能与OsHDA703互作的蛋白，为研究OsHDA703参与抗病免疫机制提供理论基础，之后需要在植物体内进行双分子荧光互补、免疫共沉淀等试验进行进一步验证。