氟喹诺酮类兽药残留高通量检测方法研究进展

刘 兵

（商丘职业技术学院，河南 商丘 476000）

一、引言

在家畜和水产品养殖过程中，为了预防和医治动物感染细菌性疾病，饲养过程中会大量使用各种抗生素[1]4183。其中，喹诺酮类抗生素在家畜和水产品养殖业中，具有抗菌范围广，杀菌彻底，价格便宜等优势。喹诺酮类抗生素（Quinolones，QNS）现已经发展到第四代，但目前我国家畜和水产品常用的是第三代氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones，FQs）[2]81。由于农户的不合理用药、过量用药和使用违禁药品等问题，FQs通过食物链在人体中大量富集，对人体的中枢神经系统和肝肾等器官产生的危害和毒性作用越来越明显[3]180，并且最新研究发现，FQs的不合理使用，造成人类的耐药性，从而降低FQs类药物在人类疾病中的疗效[4]665。我国政府对FQs残留非常重视，目前很多FQs类药物在我国食品中已禁止使用。国标GB31650—2019规定了FQs药物的最大残留量，具体如表1所示。

表1 GB31650—2019中动物源性食品中氟喹诺酮药物最大残留量（单位：ng·g-1）

随着科技的发展，用于动物源性食品的检测方法越来越多，并且很多研究在这方便取得了显著的进步，但FQs残留的检测技术大多还是集中在液相色谱及与其相关的检测方法上。本文综述了FQs类药物残留的前处理方法，以及常用的仪器检测方法，以期为保障动物源性食品的氟喹诺酮类药物用药安全提供参考依据。

二、样品前处理技术研究进展

动物源性食品检测都需要对样品进行前处理，才能进行进一步的检测。传统的液液萃取、固相萃取样品前处理方法已不能满足当代检测的需要，需要在传统方法中融入新技术和新材料，比如：分子印迹固相萃取技术、QuEChERS、超临界流体萃取技术等，给动物源性食品的药物残留检测技术节省了时间和试剂，并且在回收率、准确度、重现性等方面也取得了很大的进步。

（一）液液萃取

液液萃取法（liquid liquid extraction，LLE）是利用不同物质在溶剂中溶解度的不同，来达到分离提取被提取物的方法。孙红洋等用1%的乙酸乙酯为提取液，对鸡蛋、鸡肝脏、鸡肾脏和鸡肉等样品进行前处理，再用乙腈饱和正己烷对样品中的多余脂肪进行清除，使样品回收率达到75.5%—106%。处理后的样品采用内标法用HPLC-MS/MS法进行测定，两种药物都具有良好的线性（R2≥0.992），定量限达到5ng·g-1，通过添加四个浓度药物，两种药物的批内、批间变异系数均小于11.2%[5]57。从实验结果可以看到，采用传统的萃取法，具有操作方法简单的优点，此方法可以用于鸡蛋和鸡肉组织中喹诺酮类药物的高通量快速检测分析。王成真等先用含磷酸缓冲液的乙腈提取，然后利用蛋白质加热沉淀，用正己烷脱脂，对鸡蛋样品进行前处理，然后进行检测，5种氟喹诺酮类药物的定量下限均达到10ng·g-1以下，并且平均回收率达到92.2%—107.1%[6]617。本法用LLE和蛋白质沉淀相结合的方式进行样品前处理，方法简单、环保、快捷和回收率高，能够用于低成本大量鸡蛋样品的高通量分析，也适用于鸡蛋样品的快速检测。徐佳等利用表面活性共渗透技术，并且结合液液萃取技术，对牛奶样品进行前处理并测定，结果显示，牛奶中喹诺酮含量的最低检出限为0.3ng·mL-1—1.4ng·mL-1，并且在线性范围内，三个浓度的加标回收率为87.8%—109.0%[7]124。由此可见，随着新技术新材料的出现，传统的液液萃取前处理技术开始和这些新技术和新材料相结合，在样品前处理方面的应用越来越多。

（二）固相萃取

固相萃取（solid phase extraction，SPE）样品前处理技术，更多地是应用在一些固体样品的前处理方面，其原理是被测物与固定相萃取剂物质的官能团通过疏水作用、离子交换作用、物理吸附作用等作用力的大小来达到分离的效果。相较于LLE样品前处理方法，该方法操作简便，环境污染小，能更好地达到分离和纯化被测物的特点，应用非常广泛。并且随着分子印迹和磁性多壁碳纳米管等技术的发展，开始让其和固相萃取相结合，在待测物前处理方面的应用越来越多。

张林田等[8]85采用样品先匀浆提取，后通过PRIME HLB小柱净化，浓缩后测定的方法，建立了猪牛肉、虾、鱼食品中11种喹诺酮类药物的测定方法。因在提取溶液时，采用乙腈为提取液，并加入了0.1%甲酸，提高了样品的回收率，达到81.1%—115.9%。通过PRIME HLB小柱净化，消除磷脂类化合物的干扰，大大降低了药物的检出限，定量限低至2.0 ng·g-1，满足国标检测需要。可以看出，采用SPE样品前处理方法具有处理步骤简单，所需时间短，回收率高和环保性强等特点，能够用于低成本大量动物源性食品中的喹诺酮类药物的高通量分析。

徐潇颖等在传统的固相萃取小柱净化的基础上，加入了磁性的MWCNTs，利用磁性吸收作用，简化了SPE样品前处理的过程，并且提高了回收率，实验中17种喹诺酮类药物的三个浓度的加标回收率为78.0%—101.1%，检出限低至0.2 ng·g-1—2.0 ng·g-1[9]63。可以看出，在酸性环境下，加入的磁性多壁碳纳米管可以消除蜂蜜中的大量糖分对回收率低的影响，并且将其融入到固相萃取技术中可以省时省力，并且节约能源，简单快捷地达到样品前处理的目的，能够用于大量蜂蜜中的多组分喹诺酮类药物的高通量分析。

杨艳菲等首先用pH值为5.0的磷酸二氢钾溶液对样品中的药物残留进行提取，然后通过MISPE柱进行净化，并通过优化MISPE的淋洗液比例，来提高其对喹诺酮类药物的特异性吸附。实验结果显示，本实验建立分子印迹固相萃取，对9种FQs有特异性吸附作用，检测的定量限低至0.25ng·mL-1，三个浓度范围的回收率为65.8%—112.2%[10]1067。由此可见，把分子印迹这种方法和固相萃取相结合，来对样品进行前处理，具有操作简单，对环境友好等特点，这种方法可以用于大批量样品中喹诺酮药物残留高通量分析。

（三）QuEchERS前处理方法

QuEchERS(quick，easy，cheap，effective，rugged，safety)是在固相萃取的基础上，融入现代技术发展而来的，该方法通过加入填充材料对杂质的吸附作用，从而达到分离净化的目的。QuEchERS因其需要仪器少，操作简单，对环境友好，并且能够满足实验需要，被广泛应用于动物源性食品的前处理。

方从容等首先用提取液进行提取，再用冷冻脂质过滤，最后采用DSPE的方法进行净化，并建立同时检测125种药物残留的检测方法。结果显示，通过外标法测定，在一定线性范围内，125种药物残留的线性相关系数均大于0.99，并且能够保持平均回收率在60.4%～119.3%范围之内[11]1124。由此可见，QuECh-ERS能够有效地降低样品中的基质效应的影响，提高检测准确度和精密度，并且QuEChERS整个操作过程简便、快速，能够用于大量的鸡蛋中多组分喹诺酮类药物的高通量快速分析。

张中印等为了降低样品中蛋白质对基质的影响，采用加乙酸的乙腈溶液来提取样品，加入无机盐（Na2SO4和NaCl）促使药物残留进入有机相，最后通过优化吸附剂组合（150mgC18-EC、50mgPSA、900mgNa2SO4），来减少基质中的杂质的影响，提高实验的回收率。最终建立的HPLC-MS/MS检测方法在0.1 ng·mL-1—100 ng·mL-1线性范围内线性关系良好（R2≥0.99），14种喹诺酮类药物的检出限达到0.51ng·g-1—3.22 ng·g-1，定量检出限达到1.69 ng·g-1—10.75ng·g-1。优化后的QuEchERS处理方法的样品回收率为80.4%—110.2%[12]244。由此可见，QuEchERS样品前处理方法，对蜂蜜和蜂王浆样品的处理具有省时、成本低等优点，可以用于大量的蜂蜜中多组分喹诺酮类药物的高通量快速分析。

薛荣旋等对样品前处理方法进行优化，最终采用1%的甲酸乙腈提取，再用50 mg PSA、150 mg C18和900 mg无水硫酸钠组成的体系进行净化。采用梯度洗脱的方式，用UPLC-MS/MS法测定水产品中6种喹诺酮类药物，标准溶液的检出限为0.30ng·g-1—0.80ng·g-1，定量标准曲线为1ng·mL-1—100ng·mL-1（R2≥0.999）。三种鱼类的加标回收率为86.6%—120%[13]521。从实验的结果可以看到，QuEchERS对水产品的样品前处理方法的良好效果，药物的基质效应的影响均小于20%，并且具有使用试剂量小、省时省力等特点，适合于水产品中抗生素类药物快速高通量检测。

（四）复合式处理方法

卞华等对样品采用加入甲酸的乙腈进行提取，并比较采用各种萃取方法的萃取效果，最终发现采用复合法萃取效果最好，即先让提取液通过Oasis PRIME HLB柱，再用正己烷对过滤液进行萃取，以达到净化的目的，把处理后的样品用UPLC-MS/MS的方法进行检测。120种药物残留在线性范围内相关系数达到0.995，其中92种药物的最低检出限达到2.0ng·g-1并且回收率很好，均满足食品质量规范技术要求[14]164。由此可见，采用固相萃取和液液萃取的方式，测定牛肉、鸡肉和羊肉中的120种抗生素药物残留的方法，稳定性强，回收率高，准确度和精密度也非常理想，能够满足多组分抗生素的快速测定。

薛焕等对比QuEChERS样品前处理方法中，各种提取液、净化填料的回收率等，结果显示，以乙腈为提取溶剂，提取效率最高，以PSA和C18的混合填料比为1:2时，样品的净化回收率最好。所得样品溶液，再结合纤维膜进一步进行净化，最后建立UPLC-MS/MS检测方法。由检测结果可知，QuECh-ERS前处理方法具有分析速度快、检测限低、实验耗材少，并且能够同时测定多种喹诺酮类药物[15]389。因而，此方法能够满足对猪肉样品高通量分析的要求。

三、检测方法的研究进展

（一）高效液相色谱法

高效液相色谱技术（high performanceliquid chromatography，HPLC）是利用高压泵，将流动相送入色谱柱中，样品随流动相浸入色谱柱，样品在色谱柱中，各组分完成分离，最终进入检测器得到各组分的响应信号，从而计算出待测物的含量。HPLC因其检测速度快、应用广、检出限低、回收率高等优点，而被广泛应用到药物残留的高通量检测中。

刘亚梅等采用液液萃取的方法对样品进行前处理，并建立HPLC同时测定鸡蛋中的3种氟喹诺酮药物残留的方法，测定结果显示，三种药物的标准溶液在浓度为0.005 mg·L-1—0.05mg·L-1范围内相关系数达到1，达氟沙星的检出限更是低至0.1ng·g-1，样品的6个水平加标回收率为91.5%—98.3%[16]306。由此可见，采用HPLC检测方法测定禽蛋中氟喹诺酮类药物残留，能够满足国内外标准和法规的要求，能够用于禽蛋中喹诺酮类药物的高通量检测。

Vakh等采用磁分散固相萃取的方式，对样品进行预处理，建立HPLC测定婴幼儿肉类食品中三种氟喹诺酮类药物残留。最终通过优化实验条件，使氟罗沙星、诺氟沙星和氧氟沙星三种药物在一定浓度线性范围内，相关系数达到0.99，样品回收率达到86%—122%[17]62，并且该方法的最低检出限低于国家标准要求，证明该方法可以用于婴幼儿肉类食品中喹诺酮类药物的高通量检测。

（二）高效液相色谱-串联质谱法

高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography-mass spectrometer，HPLC-MS/MS）是目前用于动物源性食品中兽药残留检测方法最广泛的一种。待检测试样首先通过高效液相色谱的色谱柱，达到各个组分分离的目的，然后进入质谱，经过分离和离子化，最终形成相应的质谱图，进而可以对待测物进行含量分析。HPLC-MS/MS集合了色谱法和质谱法的优点，特别适用于在动物源性食品中兽药残留的检测，具有分离能力强、药物残留检测限低，检测结果准确度高等特点，HPLC-MS/MS已成为氟喹诺酮类药物残留检测的重要手段。

表2所示为不同基质中氟喹诺酮类药物的HPLC-MS/MS检测方法的比较。通过对各种文献中流动相的选择对比可以发现，由于喹诺酮类抗生素一般带有羟基，容易形成正离子，流动相的A溶液除了容易挥发的甲醇或者乙腈等有机物外，还会加入0.1%～0.2%左右的甲酸溶液，以提高离子化效率。为了缩短测定时间并更好地分离不同的FQs药物残留，一般采用梯度洗脱的方式。通过加酸和梯度洗脱的方式，来保障样品在分析过程中的稳定性，同时提高色谱的分离效率和缩短检测时间。高效液相色谱可以对样品中的成分达到很好的分离效果，从而对样品进行定性定量的分析，质谱可以通过大量碎片信息对定性结果进一步印证，从而使色谱串联质谱在样品定性和定量方面的功能更加强大。近年来三分之二的FQs药物残留检测方法均采用HPLCMS/MS的方法进行检测。并且随着科学技术的发展，超高效液相色谱与质谱串联的检测方法应用越来越广泛。总体来说，HPLC-MS/MS的检测方法不仅具备了色谱法的超强分离能力，同时还具有质谱的超高灵敏度、定性分析能力，可以使测定结果的准确度更高，结果更可靠。但是由于HPLC-MS/MS的仪器价格昂贵，限制了它的推广，导致这种方法在基层工作中难以普及。

表2 不同基质中氟喹诺酮类药物的HPLC-MS/MS检测方法的比较

（三）超高效液相色谱-飞行时间质谱

飞行时间质谱法是利用不同质量的离子在空管无场区具有不同的速度，到达检测器的时间不同，而达到分离和检测的目的。飞行时间质谱法具有扫描速度快、准确度高等特点。

李永利等采用优化后的QuEChERS方法对牛奶样品进行前处理，建立同时测定牛奶中多种FQs的UPLC-Q-TOF-MS检测方法。实验结果满足痕量检测需求，表明建立的方法可以用于牛奶样品中氟喹诺酮类药物的高通量检测[26]410。宋伟等对待测样品首先经酸化乙腈提取，然后采用碳纳米管进行净化，最终采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法进行一级初筛及二级确证的方法进行测定，从而建立了一种简便、快速、准确的高通量快速测定蟹肉中39种兽药残留的快速检测方法，同时也为其他水产品中兽药残留的检测提供方法参考[27]1267。郑明明采用固相萃取的方法对牛奶、鸡肉、鸡蛋等样品进行前处理，从而建立鸡蛋、鸡肉等食品中药物残留的UPLC-Q-TOF-MS检测方法。样品用聚甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯整体式柱进行萃取，并采用上述方法进行检测。结果显示，所采用的前处理方法良好，检测结果中没有基体的干扰，该方法可以用于多种食品中喹诺酮类药物残留的高通量检测[28]7517。

四、小结和展望

动物源性食品中氟喹诺酮类药物的高通量检测方法中，样品预处理方法和检测条件优化两个方面对检测结果的准确度和精密度起着至关重要的作用。一方面，样品前处理时药物残留提取率较低。可以通过降低提取液中的基质效应，提高样品中药物残留的回收率，提高实验结果的准确度。为了解决这一瓶颈问题，常采用的前处理方法是在传统样品前处理方法的基础上，融入现代新技术。比如，超声或微波技术、分子印迹技术或磁性吸附技术等，通过与新技术的结合提高了药物残留的提取率，降低了环境的污染，提高了最终测量结果的准确度。另一方面，选择合适的检测方法，提高检测准确度。随着新技术、新设备和新材料的不断问世，HPLC、HPLCMS、UPLC-MS等方法被广泛地应用到氟喹诺酮类药物残留的检测。最常用的检测方法是UPLC-MS，其具有检测快速、准确、重现性好等优点，但同时因其仪器昂贵、对样品前处理要求高等特点，在一定程度上限制了其在基层的推广，同时在检测过程中，基质效应对结果在定性定量方面影响较大。因而找到选择性高，能有效降低基质效应的新型材料，并把其应用到样品提取上，同时研究出选择性更高的色谱柱，分辨率更高的检测器，是目前提高动物源性食品中氟喹诺酮类残留高质量检测的重要途径。