基于响应面法优化桑葚果酒主发酵工艺及其品质评价

杨 璐，范少丽，李 宏，程 平，张志刚

(新疆林业科学院测试中心/新疆林木资源与利用国家林草局重点实验室/新疆林果树种选育与栽培重点实验室，乌鲁木齐 830054)

0 引 言

【研究意义】桑葚(FructusMori)是桑科桑属多年生木本植物[1,2]。桑葚抗氧化能力显著[3,4]，利用桑葚果实发酵制酒，并将其工业化生产提供具有一定意义。【前人研究进展】国内桑葚酒研究多集中于发酵工艺条件优化，以及加工过程中理化性质、风味物质、感官指标等变化[5-7]。叶学林等人[5]通过响应面法优化桑葚果酒发酵工艺时，以白砂糖、柠檬酸和柠檬酸钠调整果汁的起始糖度和起始pH值。杨芳等[6]通过星点设计-响应面法优化桑葚果酒发酵工艺得到最佳条件为：发酵温度为 15.3 ℃，接种量为 8.00 g/L，蔗糖加入量为 12.80 g/100 g。【本研究切入点】现有桑葚果酒研究多以桑葚果汁为发酵原料，并且大部分会在发酵原料中添加蔗糖[5-7]，鲜见未添加外源糖份的桑葚果酒.。研究采用的酿酒原料为新疆本地品种仟格丽桑葚，无需添加外源糖分。【拟解决的关键问题】在桑葚果浆主发酵12 d后滤去酒脚，再次发酵，利用Box-Behnken响应面试验优化桑葚果浆主发酵工艺流程，同时从香气、理化指标、感官评价对桑葚果酒品质进行评价，为高品质桑葚果酒的推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 桑葚

选取新鲜成熟的新疆吐鲁番本地品种仟格丽桑葚果(紫黑桑果)作为酿酒原料，可溶性固形物平均含量达 29.0°Brix。偏重亚硫酸钾、皂土、降酸酵母、果酒专用酵母、耐低温酵母LABA均购自帝伯仕自酿机有限公司。

选用27份桑葚果浆，每组果浆7 kg，分别置于10 L玻璃发酵罐中，再分别接种活化后的不同酵母品种、不同酵母浓度，设定不同温度，将不加酵母的桑葚果发酵试验作为对照试验，每组试验重复3次。在主发酵12 d时测定各组酒样理化指标。

1.1.2 主要仪器

紫外分光光度计：日本岛津；

WZS-I 型测糖仪：上海光学仪器厂；

分析天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；

7890A-5975C气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦公司。

1.2 方 法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

(1)将仟格丽桑果清洗干净；剔除坏果，低温压碎。称取7 kg桑葚果于10 L玻璃广口发酵罐中，按压破碎，破碎过程中滴加92.5 mg/kg偏重亚硫酸钾溶液(SO2浓度相当于50 mg/kg)用于护色和灭菌，偏重亚硫酸钾加入前溶解于10倍无菌水。加入果胶酶20 mg/kg，常温(20～30℃)酶解8 h。

(2)酵母活化：先将实验设定添加量的活性干酵母加入10倍体积的5%、(35±1)℃糖液中，置于(35±1)℃恒温水浴锅中，轻轻搅拌，待酵母活化 15 min，出现一层细腻的泡沫，即为活化成功。

(3)主发酵：将活化成功的酵母液加入到待发酵果浆中，于实验设定温度下发酵12 d。

(4)过滤：滤除果渣，将酒液转移至装有单项排气阀的发酵罐中，继续发酵，观察单向阀气泡产生很缓慢或无气泡出现，将果酒温度调整到 4℃，并加入50 mg/kg的SO2，及时终止发酵。

(5)陈酿：将发酵结束的果酒倒罐分离酒脚，5℃以下满罐陈酿，防止酒的氧化。视酒脚沉淀状况倒罐1～2次。

(6)澄清过滤：原酒陈酿后加入澄清剂，静置48 h以上。

(7)除菌灌装：经0.22 μm过滤机过滤除菌，过滤前加入92.5 mg/kg偏重亚硫酸钾溶液(SO2浓度相当于50 mg/kg)，偏重亚硫酸钾加入前溶解于10倍无菌水。除菌后用灌装机灌装即得成品。

(8)发酵过程中所有容器均需杀菌消毒，使用0.2%SO2溶液冲洗晾干。

1.2.3 桑葚果酒主发酵单因素试验

(1)不同酵母品种对发酵速度的影响

取桑葚果浆7 kg置于10 L玻璃发酵罐中，桑葚果浆分别接种降酸酵母、果酒专用酵母、耐低温酵母LABA，酵母浓度为0.2 g/kg，设定发酵温度为20～22℃，启动发酵。将不加酵母的桑葚果发酵试验作为对照试验，每组试验重复 3 次。在主发酵进行12 d时测定各组酒样理化指标。

(2)不同酵母浓度对发酵速度的影响

取桑葚果浆7 kg置于10 L玻璃发酵罐中，桑葚果浆接种耐低温酵母LABA，分别添加0.1、0.2、0.3g/kg 酵母量，设定发酵温度为20～22 ℃，启动发酵。将不加酵母的桑葚果发酵试验作为对照试验，每组试验重复 3 次。在主发酵进行12 d时测定各组酒样理化指标。

(3)不同发酵温度对发酵速度的影响

取桑葚果浆7 kg置于10 L玻璃发酵罐中，桑葚果浆接种 0.2 g/L耐低温酵母LABA，分别设定发酵环境温度为16～18℃、20～22℃、24～26 ℃，启动发酵。将不加酵母的桑葚果发酵试验作为对照试验，每组试验重复 3 次。在主发酵进行12 d时测定各组酒样理化指标。

1.2.4 桑葚果酒主发酵响应面试验

在单因素实验的基础上，利用Box-Behnken的中心组合设计原理，选择发酵温度、SO2添加量、酵母浓度这3个因素为自变量，以桑葚酒的酒精体积分数为响应值，进行3因素3水平的 Box-Behnken 中心组合实验设计，采用响应面法 进行优化，确定桑葚果酒最佳发酵工艺条件参数。见表1。每个样品重复测定3次。表1

表1 Box-Behnken 设计实验因素水平表及编码

1.2.5 桑葚果酒品质评价

1.2.5.1 理化指标

残糖量：用手持糖度计测定。pH：酸度计测定。酒精度：采用酒精计法。总糖：蒽酮硫酸法[10]。可滴定酸：GB/T 12456-2008的测定方法，结果以酒石酸表示[11]。总酚：Folin-酚试剂法[12]。总黄酮：硝酸铝法，以芦丁为标准品计量黄酮含量[13]。花色苷：pH示差法[14]。色差：色差仪测定[15]。

1.2.5.2 香气成分

萃取方法：在常温下，准确称取5 mL桑葚果酒于20 mL固相微萃取瓶，向瓶中放入磁子，盖紧样品瓶盖，将固相微萃取器的萃取头插入到样品瓶中，推出纤维头(未接触溶液及瓶壁)。于80℃下平衡10 min，萃取40 min，吸附后将萃取头直接插入气相色谱质谱联用仪的进样口，进样口温度250℃，解析时间5 min，开启仪器并采集数据。

色谱条件：色谱柱毛细柱HP 5-MS(30 m × 0.25 mm×0.25 μm)，载气：He(99.999%)，流速 1.00 mL/min；进样方式：无分流手动进样；进样口温度：250℃。表2

表2 色谱条件：升温程序

质谱条件：电离方式EI，电子能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，传输线温度250℃。扫描质荷比范围(m/z)30～550。

1.2.5.3 感官

以鲁榕榕[16]等感观分析的方法基础上，略做改动，对通过最优主发酵工艺得到的桑葚果酒进行了感官分析，对样品澄清度、色泽、香气(浓郁度、丰富感、果香、异味)、滋味(酸度、浓郁度、余味长短、协调感)9个指标进行感官评价，使用5 分结构化数值尺度来量化，0～4表示感觉强烈程度逐渐增大。

1.3 数据处理

谱图检索及成分鉴定由SPME-GC/MS操作得到各样品的质谱相对丰度图及总离子流(total ion current，TIC)图。对 TIC 图中各有效峰代表的化学信息，标准谱库 NIST 11.0，对比经典气相色谱化合物保留时间数据，鉴定桑葚果酒挥发物组分中的化学成分，并用峰面积归一化法计算各化合物在总挥发性组分中的相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 不同酵母品种对桑葚果酒主发酵的影响

研究表明，在桑葚果浆主发酵进行12 d后，耐低温酵母LABA发酵的酒浆酒精度显著高于降酸酵母发酵酒浆(P<0.05)，且还原糖含量、残糖量显著高于降酸酵母发酵的酒浆(P<0.05)。降酸酵母发酵酒浆酒精度最低，残糖量、还原糖最高，发酵力低于其他酵母。发酵力略低于耐低温酵母LABA，但无明显差异，发酵效果居中，但是前者可滴定酸含量较高，对桑葚果酒口感造成一定影响。相同时间内耐低温酵母LABA酒精转换能力较好，且不会造成酸度过高，降低桑葚果酒的柔和指数。选用耐低温酵母LABA作为桑葚果酒发酵酵母。添加酵母实验组于空白实验组相比各项指标差异显著(P<0.05)，桑葚果浆空白组不添加酵母也可以启动自然发酵。但自然发酵起酵慢，且不稳定，易被杂菌的污染，导致成品酒液之间质量差异大。图1

注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)，下同

2.2 不同酵母浓度对桑葚果酒主发酵的影响

研究表明，添加酵母实验组于空白实验组相比各项指标差异显著(P<0.05)，不同酵母添加量的主发酵结果仍存在一定差异。当酵母添加量为0.1 g/kg时，发酵效果低于其他酵母。0.2与0.3 g/kg酵母添加量发酵效果无明显差异，0.2 g/kg酵母添加量酒浆酒精度最高的。选用桑葚果酒主发酵酵母添加量为0.2 g/kg。图2

图2 不同酵母浓度下桑葚果酒酒精度、pH、还原糖、残糖量、可滴定酸变化

2.3 不同发酵温度对桑葚酒主发酵的影响

研究表明，发酵温度对桑葚果酒主发酵过程中pH和可滴定酸的影响较大，当发酵温度在24～26℃时，桑葚酒浆pH值最小，且可滴定酸含量显著高于其它实验组(P<0.05)，对桑葚果酒口感造成一定影响。可滴定酸是评价果酒品质的重要指标，合适的酸度可以使桑葚果酒酒体协调，口感酸甜；若可滴定酸含量过高，将带来尖酸感和不愉快的醋味，降低桑葚果酒的柔和指数，其感官风味与整体品质造成一定影响；在桑葚果酒主发酵过程中，可滴定酸含量过高，会影响酵母中后期发酵能力，导致发酵异常。图3

图3 不同发酵温度下桑葚果酒酒精度、pH、还原糖、残糖量、可滴定酸变化

2.4 响应面多元回归模型

研究表明，桑葚果酒主发酵工艺参数的二次回归方程为：Y=11.28+0.062A+0.59B+0.20C+0.050AB-0.27AC-0.23BC-0.44A2-0.59B2-0.015C2。该方程的多元相关系数R2为0.946 0，该回归模型与实际结果拟合较好。表3

表3 响应面试验设计及结果

研究表明，模型的显著性水平P<0.01，该二次方程模型极为显著，通过因素之间交互作用3D响应面曲面图，以及回归方程系数显著性检验有显著的交互作用的因素为SO2添加量和酵母浓度，其他因素之间交互效应不显著。利用模型得到桑葚果酒最佳主发酵工艺条件为酵母浓度0.222 5 mg/kg、发酵温度21.192～23.192℃、SO2添加量为80 mg/kg，预测酒精度为11.543%vol。最优工艺条件调整为酵母浓度0.22 mg/kg、发酵温度21～23℃、SO2添加量为80 mg/kg，测得酒精度为11.3%，实际测量值接近预测值，回归模型有效。表4，图4

表4 实验结果回归模型方差

图4 因素之间交互作用3D响应曲面

2.5 桑葚果酒香气

研究表明，桑葚果酒共检测出24种挥发性香气化合物，酯类化合物相对含量最高(77.861%)，相对含量排在前3位的酯类物质分别为：癸酸乙酯(20.163%)、月桂酸乙酯(16.716%)、辛酸乙酯(9.659%)，带给桑葚果酒果香、甜香等多样香气。其次醇类化合物相对含量排名第二(19.066%)，包括乙醇(17.972%)与苯乙醇(1.094%)。表5

表5 各处理酒样中挥发性香气化合物的 GC-MS 分析

2.6 桑葚果酒理化指标

研究表明，最优主发酵工艺得到的桑葚果酒，入口酸甜可口、浓郁丰富，色泽光亮、呈浓郁的紫红色，酒香和谐、具有独特桑葚果实香气。虽然无明显悬浮物和沉淀物，但是澄清度较低，需要在陈酿步骤后，利用化学澄清剂以及机械澄清技术，使桑葚果酒最终成品外观澄清透亮。表6，图5

表6 桑葚果酒理化指标

图5 感官分析雷达图

3 讨 论

醇类化合物在桑葚果酒中既是芳香物质，又是呈味物质，其中苯乙醇带给酒体一种玫瑰花香和甜香[20]。当酵母添加量过低时，发酵效果低于其他酵母。因为酵母添加量过小，酵母菌增殖缓慢，在主发酵初始阶段易被杂菌污染，且限制酒浆酒精度增长。若酵母添加量过高，起酵快，酵母菌迅速增殖，可避免杂菌生长，产生酒液多，但过多添加量会使酒浆发酵过快，导致影响桑葚果酒感官风味的产物积累过多，并且会增加成本，这与吴梦[20]研究结果一致。通过研究发现发酵温度对桑葚果酒主发酵过程中pH和可滴定酸的影响较大，姚远[21]对桑葚米酒发酵工艺进行优化也得出结论随着发酵温度的提高，发酵速度过快，会导致酒样酸度增高，口感变酸、变涩影响食用品质。可滴定酸是评价果酒品质的重要指标，合适的酸度可以使桑葚果酒酒体协调，口感酸甜；若可滴定酸含量过高，将给人带来尖酸感和不愉快的醋味，降低桑葚果酒的柔和指数，其感官风味与整体品质造成一定影响；同时，在桑葚果酒主发酵过程中，可滴定酸含量过高，会影响酵母中后期发酵能力，导致发酵异常。通过SPME-GC/MS检测分析，桑葚果酒香气化合物中酯类化合物与醇类化合物相对含量较高，对酒体品质的优劣有相当重要的作用，带给桑葚果酒果香、甜香等多样香气，在醇类香气中以发酵产生的苯乙醇为主，具有柔和持久的玫瑰香、紫罗兰香、茉莉花香等多样风味，对果酒香气的形成有积极作用，这与孙佳勰等[22]研究结果一致。通过感官分析可知，利用最优主发酵工艺得到的桑葚果酒品质优，但是余味较短，澄清度较低，需要进行陈酿澄清步骤。同时桑葚果酒总酚、总黄酮、花色苷含量均高于现有研究制得的发酵型桑葚酒，考虑进一步研究其抗氧化能力。

4 结 论

桑葚果酒最优主发酵工艺参数：酵母添加量0.22 g/kg、发酵温度21～23 ℃、SO2添加量为80 mg/kg。通过最优主发酵工艺得到的桑葚果酒不仅口感佳，色泽浓郁紫红色，具有独特桑葚果实香气，利用SPME-GC/MS技术共检测出24种挥发性香气化合物，酯类化合物相对含量最高(77.861%)，其次醇类化合物(19.066%)。