高效液相色谱法测定牛奶中3种防腐剂

马晓年，陈俊秀，农蕊瑜，李文廷，蒋梦

（1.昆明市疾病预防控制中心，昆明 650228；2.昆明医科大学，昆明 650500）

0 引言

牛奶能为人体提供多种营养物质[1]，在日常生活中不可或缺。食品防腐剂具有良好的杀菌作用[2]，能延长食品保质期，被广泛应用于食品加工中。

少量的食品添加剂对人体没有影响，过量则会对人体健康造成损害[3]。国标对于食品防腐剂的添加做出了明确规定[4]，苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸不能添加到牛奶中。目前,国内的研究中检测3种防腐剂的方法主要有：气相色谱法[5-7]、液相色谱法[8-10、13-14]、薄层色谱法[11]，但能同时快速检测3种防腐剂的方法较少。本文对实验条件进行研究改进，建立了高效液相色谱法同时测定牛奶中3种防腐剂。结果表明，该法快速、准确、简便，适合于日常检验。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo U3000高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器）,美国赛默飞;高速冷冻离心机，湖南 赫西仪器;电子天平（0.01 mg）,Sartorius。

牛奶，市购；苯甲酸（坛墨质检-标准物质中心）；山梨酸、脱氢乙酸，坛墨质检-标准物质中心；甲醇（色谱纯），美国JT Baker；乙腈（色谱纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、乙酸胺（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；乙酸（分析纯），北京化工厂。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

准确量取苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸标准溶液各1 mL，用纯水定容至10 mL，得到苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸均为100μg/mL的混合标准应用液。混合标准应用液保存于4℃冰箱内备用。

1.2.2 样品前处理

0.2 %乙酸沉淀法：准确称取2 g样品于50 mL离心管中,加入10 mL体积分数为0.2%乙酸水溶液,涡旋2 min,于转速4 000 r/min离心1 min,留取上清液,残渣重复上述操作两次,合并水相,并用体积分数0.2%乙酸溶液定容至30 mL,混匀。取适量上清液过0.22μm滤膜,待液相色谱测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相A为浓度0.02 mol/L乙的酸铵溶液，流动相B为乙腈,梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；检测波长为230 nm；进样量为10μL；柱温为室温。洗脱条件如表1所示。

表1 流动相梯度洗脱

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

在200～300 nm范围内对分析物进行紫外波长扫描，结果发现,在流动相中3个组分的最大吸收波长分别是苯甲酸230 nm、山梨酸254 nm、脱氢乙酸230 nm。为兼顾各组分的灵敏度和吸收峰值，在实验中对比254 nm和230 nm波长处取得的混合组分色谱图，根据各组分紫外吸收情况，确定在230 nm波长处检测苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸均取得更高响应如见图1所示，故选用230 nm作为本实验的检测波长。

图1 不同检测波长下3种物质的标准色谱

2.1.2 流动相的选择

本文实验了甲醇-乙酸铵、乙腈-乙酸铵、乙腈-磷酸二氢钾，并调整有机相及水相比例以得到最佳的分离效果。实验表明，磷酸二氢钾作为水相时，在不改变pH的情况下，苯甲酸和山梨酸无法实现基线分离，改变流动相比例改善效果也并不显著；乙酸铵作为水相则可较好的分离3种防腐剂，甲醇作为有机相，3种防腐剂均可实现基线分离，分析时间约为15 min；乙腈作为有机相，3种防腐剂均实现基线分离且峰型收窄，响应增大，分析时间在7 min内如见图2所示。综上所述，本文选择乙腈-乙酸铵作为流动相进行后续分析工作。

图2 不同流动相下3种物质的标准色谱图

2.2 样品前处理方法的确定

牛奶样品中的蛋白质会干扰测定结果，故需除去蛋白质。目前除蛋白有沉淀法和萃取法两大类[15]。实验主要考察了沉淀法中的GB 5009.28-2016[12]无机试剂乙酸锌-亚铁氰化钾沉淀蛋白及有机试剂沉淀蛋白。

本文对苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸进行加标6次重复平行实验，对比3种方法的加标回收率和相对偏差值,结果如表2所示。实验发现，国标方法过程较为繁琐，苯甲酸的回收率在82.6%～116.2%，虽达到方法验证学的要求，但RSD大于10%，实验重复性不佳；山梨酸的回收率较低，在60.6%～70.0%；脱氢乙酸的回收率则完全达不到方法学要求。

表2 不同前处理方法样品的平均加标回收率

本文试验了甲醇及乙酸两种有机溶剂沉淀蛋白。采用甲醇沉淀蛋白质对苯甲酸、山梨酸的回收率基本达到要求，但实验中存在沉淀不完全的现象，且脱氢乙酸的回收率低至56.8%~70%。乙酸对水的亲和力较大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀，故体积分数为0.2%乙酸沉淀法能克服实验过程繁琐、沉淀不完全两个缺点，取得理想效果，对3种组分的回收率在82.3%～104.0%，RSD在4.5%～5.6%。综合考 虑，因而选择体积分数0.2%乙酸作为蛋白质沉淀剂。

2.3 样品提取次数的选择

试验按样品前处理的步骤，对比了体积分数为0.2%乙酸分别对加标样品进行1次和3次提取，最后用体积分数为0.2%乙酸定容至30 mL，每个加标水平重复4次，得出样品的平均加标回收率和RSD值，实验结果如表3所示。

表3 不同提取次数的样品加标回收率

从表中可以看出，采用3次提取各组分的加标回收率均优于1次提取，且3次提取的RSD值小于1次提取，重复性较好。为确保实验准确性，实验再次使用体积分数为0.2%乙酸进行4次提取，发现其平均回收率在88.4%～95.1%，和3次提取结果无显著性差异，因而提取次数选择3次。

2.4 标准曲线及检出限

用纯水将混合标准应用液配制成含苯甲酸质量浓度分别为1.56，12.5，25.0，50.0，100.0μg/mL；含山梨酸质 量 浓 度 分 别 为0.78，6.25，12.5，25.0，50.0μg/mL；含脱氢乙酸质量浓度分别为3.12，6.25，12.5，25.0，50.0μg/mL的标准工作溶液；在确定的分析条件下进行测定，采用外标法以峰面积计算定量,以质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到的线性方程、相关系数、检出限及定量限如表4所示。

表4 3种组分的线性方程、相关系数、检出限及定量限mg/g

2.5 回收率和精密度实验

取不含苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的牛奶样品，加入高中低3个浓度梯度的防腐剂混标，加标浓度分别见表5，分别测定6次，计算其平均回收率和精密度。苯甲酸平均回收率在86.7%～101.0%，RSD在3.6%～5.7%；山梨酸平均回收率在83.4%～91.9%，RSD在4.4%～6.0%；脱氢乙酸平均回收率在90.1%～97.2%，RSD在3.9%～5.1%。图3为牛奶样品加入3种混标的色谱图，由图可见，3种组分与杂质峰完全分离，无干扰，可准确定性、定量检测。

表5 样品加标回收率结果

图3 加标样品色谱图

3 结论

在本方法的条件下，3种防腐剂与牛奶中其他干扰杂质峰完全分离，在10 min内可快速检测出，且定量准确。可以节约检测成本并提高检测效率，适合牛奶中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的日常监控测定。