β-D-葡萄糖苷酶对5种菊花总黄酮的影响

章 娟，赵宏苏，陈慧芳，熊俊伟，徐少君，张 伟，3，吴德玲，3

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安庆医药高等专科学校药学系，安徽 安庆 246052；3.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012)

菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序[1]，主要含有黄酮类、挥发油、苯丙素类、萜类、氨基酸等成分，其中黄酮类和苯丙素类化合物为菊花的主要药效成分[2-7]。菊花总黄酮作为药用菊花的主要活性成分[8]，与菊花的传统功效密切相关。现代药理学研究[9-13]表明，菊花总黄酮具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗糖尿病等作用，此外对心血管也有一定的作用，其含量高低是评价中药菊花质量优劣的重要依据。2020年版《中华人民共和国药典》[1]按产地和加工方法不同，将菊花分为“亳菊”“滁菊”“贡菊”“杭菊”“怀菊”等品种。9—11月花盛开时分批采收，阴干或焙干，或熏、蒸后晒干，其炮制目的在于“杀酶保苷”。前期实验研究[14-15]发现，β-D-葡萄糖苷酶可以水解亳菊中黄酮苷类成分，并且β-D-葡萄糖苷酶水解亳菊总黄酮是烘干过程中黄酮苷元含量升高的原因之一。而不同品种菊花中多种黄酮苷类成分均是β-D-葡萄糖-O-苷，考虑β-D-葡萄糖苷酶可用于水解结合于末端、非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。因此，本实验基于“杀酶保苷”的炮制目的，研究β-D-葡萄糖苷酶对5种菊花黄酮类成分的影响，探究β-D-葡萄糖苷酶在5种药用菊花加工炮制中的作用，为不同品种药用菊花的加工方法提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-2030C 3D液相色谱仪：美国ABSCIEX公司；BSA224S十万分之一电子分析天平：赛多利斯；F80型高速多功能粉碎机：玖蓝五金制品有限公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；HH-S恒温水浴锅：江苏国胜实验仪器厂；KQ-500DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；PALL超纯水机：美国Milipore公司。

1.2 试药 乙腈为色谱纯：欧普森；甲酸为分析纯：上海苏懿化学试剂有限公司；超纯水：PALL超纯水机；芹菜素(批号 PS010177)、芹菜苷(批号 PS011186)、木犀草素(批号 PS010346)、木犀草苷(批号 PS000708)、金合欢素(批号 PS011043)、香叶木素(批号 PS010395)、香叶木苷(批号 PS011578)：均购于成都普思生物科技股份有限公司，纯度均大于98.0%；β-D葡萄糖苷酶(7.4 U/mg)：sigma公司；实验样品为亳菊、滁菊、贡菊、杭菊、怀菊，分别采收于安徽亳州、安徽滁州、安徽黄山、浙江桐乡、河南焦作，经安徽中医药大学俞年军教授鉴定为菊科植物亳菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘boju’cv.nov.、滁菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘chuju’cv.nov.、贡菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘gongju’cv.nov.、杭菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘hangju’cv.nov.、怀菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘huaiju’cv.nov.的干燥头状花序。

2 方法

2.1 色谱条件 Agilent XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脱(0～8 min，5%～10% A；8～15 min，10%～14% A；15～18 min，14%～17% A；18～22 min，17%～17.5% A；22～35 min，17.5%～18% A；35～40 min，18% A；40～50 min，18%～19% A；50～65 min，19%～30% A；65～80 min，30%～52% A)；检测波长：348 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃。混合对照品溶液及供试品溶液高效液相色谱图见图1。

注：1.木犀草苷；2.芹菜苷；3.香叶木苷；4.木犀草素；5.芹菜素；6.香叶木素；7.金合欢素

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取木犀草苷、芹菜苷、香叶木苷、香叶木素、芹菜素、木犀草素、金合欢素对照品适量，用70%甲醇定容，制成每毫升含有木犀草苷0.195 mg、芹菜苷0.205 mg、香叶木苷0.210 mg、木犀草素0.125 mg、芹菜素0.238 mg、香叶木素0.188 mg、金合欢素0.188 mg的对照品溶液。

2.3 菊花提取物溶液的制备 取菊花样品粉末(过一号筛)0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率300 W，频率45 Hz)40 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 供试品溶液的制备 分别将各菊花提取物，减压蒸干，用100 mmol/L、pH 4.0的柠檬酸缓冲溶液定容，制成每毫升含6 mg菊花提取物的底物溶液。将底物溶液放在50 ℃水浴锅中孵育，待其完全溶解，迅速精密吸取0.2 mL的底物溶液与等量的β-D-葡萄糖苷酶溶液于1.5 mL的离心管中混合，分别在4 ℃、50 ℃、100 ℃条件下水浴反应1 h后，加入1 mL甲醇终止反应。混匀后，8 000 r/min离心15 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.5 含量测定

2.5.1 线性关系 分别精密吸取“2.2”项下制备的对照品溶液，用70%甲醇逐级稀释成2、4、8、16、32、64、128、256倍溶液，摇匀，配成混合对照品溶液。分别进样10 μL，注入高效液相色谱仪中，以对照品溶液质量浓度为横坐标(x)，峰面积的积分为纵坐标(y)，绘制标准曲线，计算标准曲线回归方程。见表1。

表1 线性回归方程

2.5.2 精密度试验 精密吸取上述混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，依法测定。测得木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香叶木苷、香叶木素和金合欢素的精密度的RSD值分别为1.06%、1.02%、1.08%、1.14%、1.01%、1.16%、1.08%，说明仪器性能良好，精密度实验结果符合有关要求。

2.5.3 重复性试验 精密称取同一样品6份，按照“2.3”项下方法处理，在上述色谱条件下测定，测定峰面积积分值，计算RSD。木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香叶木苷、香叶木素和金合欢素峰面积RSD(n=6)分别为0.78%、2.05%、0.57%、1.14%、0.53%、1.04%、0.57%。结果表明该方法的重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 精密吸取上述混合对照品溶液10 μL，分别于0、2、8、10、12、24 h进样，共6次，由峰面积值统计结果计算稳定性的相对峰面积的RSD值分别为1.44%、0.22%、0.85%、0.28%、1.01%、0.79%、0.15%。结果表明该方法的稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取已知含量的菊花样品，精密称取6份，每份0.125 g。分别精密加入高、中、低浓度的木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香叶木苷、香叶木素和金合欢素对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述高效液相色谱条件下进行测定，计算回收率。结果表明，木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香叶木苷、香叶木素和金合欢素的平均回收率分别为97.14%、97.52%、98.72%、99.47%、98.24%、98.33%、99.41%，RSD(n=6)分别为1.30%、1.41%、2.65%、1.52%、1.95%、1.11%、1.06%。

2.5.6 5种药用菊花含量测定 按“2.3”“2.4”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，计算5种菊花样品提取物及经不同加工处理后的成分含量，结果见表2。

表2 5种药用菊花加工后多指标成分含量(μg/mL，n=3)

3 结果与分析

实验结果表明，5种菊花中木犀草苷、香叶木苷和芹菜苷的含量在40 ℃和100 ℃的条件较高，而木犀草素、香叶木素、芹菜素、金合欢素的含量在50 ℃的条件下较高，4 ℃和100 ℃的条件下含量较低，除了亳菊和滁菊中的芹菜素在4 ℃条件下含量最高外，总体上呈现一个共性规律，符合“杀酶保苷”的炮制目的。β-D-葡萄糖苷酶活性受温度影响较大，低温时酶活性较低，随着温度升高，酶活性增大，但温度过高又可能使酶变性[15]。50 ℃酶活性较大，β-D-葡萄糖苷酶水解黄酮苷类成分，从而导致苷元类成分木犀草素、香叶木素、芹菜素、金合欢素含量升高，而4 ℃和100 ℃时酶活力较低，4 ℃时酶活性被抑制，100 ℃时酶被灭活，与激活酶组(50 ℃)相比，抑制酶(4 ℃)或灭活酶组(100 ℃)水解反应被抑制，因此木犀草苷等黄酮苷类成分含量升高，与之对应的苷元类成分含量降低。

由于菊花品种、生长环境、气候、土壤等不同，不同菊花之间总黄酮含量存在差异(见图2)。不同菊花经过不同加工方法处理，抑制、激活或灭活酶水解总黄酮后，得到的木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香叶木苷、香叶木素、金合欢素这7种黄酮类成分总量也存在差异(见图3)。通过实验结果可发现，在50 ℃条件下黄酮苷总量较低，但总黄酮含量较高(除金合欢素)。酶在被抑制状态(4 ℃)和灭活状态(50 ℃)菊花中黄酮苷含量较高，酶被激活状态(50 ℃)时，菊花中黄酮苷被水解，黄酮苷含量降低，黄酮苷元含量升高。与4 ℃和100 ℃条件下比较，50 ℃条件下测得的黄酮类化合物总量较高，推测在50 ℃条件下导致其他苷转化成木犀草素等苷元，从而使得所测得的黄酮类成分总量升高。与酶活性被抑制状态(4 ℃)相比，除杭菊外，绝大多数菊花在灭活酶条件下(100 ℃)测得的黄酮苷类成分总含量较高。

图2 5种药用菊花不同温度处理后的黄酮类成分含量变化图

注：A.亳菊4 ℃；B.亳菊50 ℃；C.亳菊100 ℃；D.滁菊4 ℃；E.滁菊50 ℃；F.滁菊100 ℃；G.贡菊4 ℃；H.贡菊50 ℃；I.贡菊100 ℃；J.杭菊4 ℃；K.杭菊50 ℃；L.杭菊100 ℃；M.怀菊4 ℃；N.怀菊50 ℃；O.怀菊100 ℃

4 讨论

研究表明，体外烘干过程中β-D葡萄糖苷酶可酶解亳菊中黄酮类成分，且在水浴50 ℃下反应最完全[16]。而左亚峰等[14]也从亳菊中分离纯化得到β-D-葡萄糖苷酶，并证明其在体内水解与体外水解一致，推测出β-D-葡萄糖苷酶水解亳菊总黄酮是烘干过程中黄酮苷元含量升高的原因之一。且β-D-葡萄糖苷酶的活性受温度影响较大[15]。

实验通过对比了不同温度条件时，5种菊花提取物在β-D-葡萄糖苷酶作用下的7种黄酮类化合物(木犀草苷及苷元、芹菜苷及苷元、香叶木苷及苷元、金合欢素)，发现不同药用菊花在β-D-葡萄糖苷酶作用下均会发生黄酮苷水解，从而苷元含量升高，这与传统加工过程中“杀酶保苷”的炮制目的一致。

2020年版《中华人民共和国药典》[1]中规定木犀草苷为质量评价的标准之一。通过实验观察对比发现，高温和低温时(抑制或灭活酶)条件下，5种菊花中木犀草苷含量较高，因此控制药材的加工温度对药材质量要求有一定的意义。后期将以传统菊花加工炮制过程中杀(抑)酶保苷的共性规律为切入点，系统研究5种菊花中自身酶在菊花炮制加工中的作用，为制定合理的菊花现代加工炮制工艺提供依据。