濒危药用植物八角莲保育研究△

陈东亮，钟楚，简少芬，李林轩，韦坤华*，缪剑华*

1.广西壮族自治区药用植物园 广西药用资源保护与遗传改良重点实验室/广西壮族自治区中药资源智慧创制工程研究中心，广西 南宁 530023；2.广西壮族自治区农业科学院 经济作物研究所，广西 南宁 530007

八角莲Dysosma versipellis（Hance）M.Cheng ex Ying别名山荷叶、金魁莲、旱八角、荷叶莲、江边一碗水、独角莲等，为小檗科（Berberidaceae）鬼臼属（Dysosma）多年生宿根草本药用植物[1]。八角莲始载于《神农本草经》，以“鬼臼”之名列为下品，“主杀蛊毒鬼注，精物，辟恶气不祥，逐邪，解百毒”[2]。据《本草纲目》[3]、《证类本草》[4]、《植物名实图考》[5]和《全国中草药汇编》[1]等文献记载，八角莲以根茎入药，能够清热解毒、祛瘀消肿、化痰散结，治疗痈肿、跌打损伤、咽喉肿痛等[6]。现代药理研究表明，其根状茎中鬼臼毒素（podophyllotoxin）含量极高，具有较好的抗肿瘤、抗病毒及抗菌等生物活性[7]。近年来，八角莲的开发利用备受关注。然而，据野外调查显示，1960 年以前八角莲在比较偏僻山区较为常见，1975 年后主要分布于自然保护区或以农家栽培形式生存。随着人类对自然的不断索取，八角莲的适生环境正在缩小，资源急剧减少[8]。这说明人们对其植物资源的开发和利用缺乏科学的指导且保育意识淡薄。目前，八角莲已被列为国家Ⅱ级保护濒危植物[9]。因此，加强其保育研究对实现八角莲资源的可持续利用具有重要意义。

1 资源现状

八角莲是我国特有的濒危植物[10]。其大多为零星分布，种群数量小，主要分布于湖北、贵州、广西、四川、江西、重庆、陕西、湖南、云南、安徽、广东、浙江等地，陕西南部大巴山北坡为其分布的最北界[11]。王万海等[12]通过查阅文献、走访市场等方式对湖北恩施地区的15 个样地（N29°22′11.3″～30°50′10.2″，E110°18′50.0″～108°55′57.8″）的八角莲野生资源进行了实地调查，并对样地八角莲的蕴藏量进行了估算，认为恩施产区的八角莲蕴藏总量约为832.91 kg，年允收量仅为138.8 kg，且调查发现很多分布区的八角莲已几近灭绝。韦蓉静等[13]对贵州省黔南州三都县八角莲群落进行生态学调查及生态位分析，认为该地区八角莲生态位宽度较小且种间竞争激烈，自然条件下生长状态与其他常见物种比较处于劣势。管毕财[8]在2006 年对湖北神农架、重庆金佛山、四川峨眉山等10 个八角莲群体进行调查，发现八角莲适宜生境正在缩小，资源急剧减少，各群体之间呈明显间断的“岛屿状”分布，且大群体越来越小，小群体逐渐消失，栖息地退缩到了人类日常活动不曾触及的森林，甚至自然保护区内的群体也被偷采，导致其栖息地不断缩小。

2 濒危成因

2.1 内部致濒因子

2.1.1 自交不亲和障碍 Bawa[14]认为，当大多数自花授粉植株不结实时，这个种就应被认为具有自交不亲和的繁育系统。管毕财[8]对八角莲进行了套袋实验、自花传粉实验和同株异花实验，发现同株同花和同株异花授粉均不结实或结实量极少，而异株异花结实率极高，表明八角莲繁育系统存在较高程度的自交不亲和障碍；通过对八角莲繁殖系统的进一步研究，认为八角莲属于自交不亲和的专性异花授粉植物，授粉主要依赖传粉昆虫，且通过观察发现有效传粉昆虫长角甲虫（long hornbeetle）的飞行距离不超过2 m，访花频率很低，造成八角莲群体间缺乏有效的花粉传播。这是其结实率低的主要原因，也是造成八角莲濒危的重要内部因子。

2.1.2 遗传多样性低 周新闻[15]利用等位酶技术和简单序列重复区间扩增多态性（ISSR）分析技术研究了八角莲5 个居群和六角莲1 个居群遗传变异情况，认为八角莲居群的遗传多样性水平低于六角莲。李忠超[16]研究认为，由于八角莲生境片段化、异质化，地理空间隔离和繁育机制障碍，其种群间基因流小，种群内遗传多样性水平较低，种群间遗传分化较大，小种群效应明显。以上研究结果均表明，八角莲的遗传多样性低、进化潜力和适应性较弱。

2.1.3 自然繁殖率低 八角莲自然状态下靠种子繁殖后代，但刘燕琴等[17]研究发现，其种子具有休眠的特点，休眠期从8月到次年的3月。种子休眠期越长，种子活力就越容易丧失[18]，致使自然繁殖率较低，这可能是野外很难观察到八角莲种子苗的主要原因。

2.2 外部致濒因子

2.2.1 野生资源的过度采挖 由金文等[19]在湖北神农架地区走访调查发现，2004 年有人从巴东沿渡河一次性挖走八角莲根茎超过150 kg，神农架林区附近林丛中八角莲已近枯竭。由于无节制、掠夺性采挖，八角莲野生资源及其生境受到了严重破坏，原分布地区资源已临近枯竭，全国的野生资源分布呈缩小的趋势。

2.2.2 生长环境的破坏 2006年管毕财[8]对全国10个八角莲主要分布区的生境调查显示，除湖南天平山自然保护区、安徽天堂寨自然保护区及江西九江海行乡3 个分布区的生境仍适宜八角莲繁殖外，湖北神农架、重庆南川、四川峨眉山、陕西岚皋南宫山、湖北九宫山和重庆缙云山的八角莲生境均受到不同程度的破坏。近年来，由于违反自然规律的垦殖、旅游开发和生态环境恶化等原因，八角莲丧失了适宜的生存环境，造成其野生资源日益减少，濒临枯竭[20]。

以上内因和外因的共同作用加剧了药用植物八角莲的濒危程度。因此，研究八角莲的就地保育、迁地保育和回归保育对濒危药用植物八角莲的可持续利用具有重要意义。

3 就地保育

就地保育主要通过封禁、轮采、人工授粉、人工补种及人工管理等方式对药用植物实现有效保护。刘燕琴等[21]通过人工授粉和人工补种方法，对分布于重庆市南川区的庙坝石人山、松丰对窝山、槐坪山的野生八角莲资源进行了人工抚育研究，分别统计人工授粉的结实率和人工补种的成活率，结果发现，经过人工授粉处理，庙坝石人山、松丰对窝山、槐坪山的八角莲结实率分别由原来的8.1%、5.0%、2.5%提高到73.4%、91.6%、30.0%；人工补种八角莲栽培苗、种子苗、组培定植苗、组培苗，成活率依次为96.7%、93.3%、50.0%、15.0%；定植1年，根部增质量依次为80.0%、86.2%、103%、120%。人工授粉有效提高了野生八角莲的结实率，人工补种方式能够有效增加八角莲的种群数量及种群内个体数。

4 迁地保育

植物迁地保育指把植物活体、器官和组织等转移到自然生境之外来繁育生长的一种保育方式，是植物多样性保护的重要补充手段[22]。对于以残存种群或由于自然、人为因素造成生境条件已经发生改变的濒危物种而言，迁地保育是必要且最为有效的措施。药用植物园、药用专类园、药用植物种质圃等是目前开展药用植物迁地保育的主要单位。将自然生境的药用植物物种转移到可控条件的地区保存，能方便研究药用植物的遗传、繁殖、生长发育规律，提取药用植物有效成分，研究药用植物药效形成与维持规律。这些规律对药用植物保育起基础支持的作用。

4.1 引种驯化

4.1.1 人工栽培 近年来，八角莲各种内部和外部致濒因子的共同作用使其濒临灭绝。实践证明，野生变家种是实现野生药用植物资源有效保护和可持续利用的有效途径。早在20 世纪80 年代，人们就开始了八角莲野生转家种的栽培研究[23]。经过30 余年的研究积累，对于八角莲的引种栽培技术已经取得了初步成果。甘国菊等[24]在前人研究基础上，总结了八角莲的人工栽培技术，主要包括选地整地、育苗、定植、搭设荫棚、中耕除草、肥水管理、病虫害防治等内容，为广大药农提供了技术指导。刘少轩等[25]选用3 年生八角莲苗，在半枫荷林不同郁闭度及空地种植，进行了栽培试验，研究认为，适宜种植八角莲的半枫荷林分最佳郁闭度为0.5～0.7，在这个郁闭度之间八角莲的成活率、保存率及生长量都较好。陆炜强[26]研究了八角莲规范化生产关键技术，依照我国中药材产品标准规范，制定了适用于浙江省磐安县八角莲生产基地及其毗邻地区的八角莲规范化生产标准操作规程。为了进一步规范中药八角莲栽培技术，原国家林业局发布了《八角莲栽培技术规程》（LY/T 2952—2018）[27]。该标准的实施有效规范了中药材八角莲的生产过程，在一定程度上保证了药材质量。为了保护野生资源及满足市场需求，四川省自然资源科学研究院秦小波等[28]通过对峨眉山特有八角莲，特别是发现的新变种峨眉八角莲进行了多年资源圃保育及繁殖，基本驯化了峨眉八角莲，并将其应用于当地人工栽培示范。该团队从2012 年起连续在峨眉山进行最小3.33 hm2的试种，与当地企业合作栽培八角莲2.67 hm2，此后面积增加达百亩（1亩≈666.67 m2），亩产鲜质量达1000 kg。

4.1.2 引种材料 中药材八角莲的基原植物为八角莲。此外，还有云南八角莲D.aurantiocaulis（Hand.‑Mazz.）Hu、小八角莲D.difformis（Hemsl.et Wils.）T.H.Wang ex Ying、贵州八角莲D.majorensis（Gagnepain）M.Hiroe、六角莲D.pleiantha（Hance）Woodson、西藏八角莲D.tsayuensisYing 等变种[10]，引种时要加以区分。内部转录间隔区2（ITS2）序列作为DNA 条形码可准确鉴别八角莲药材的基原植物及其混伪品，为八角莲物种鉴定及药材真伪鉴别提供依据[29‑30]。因其野外自然状态下产种量极少，农家引种时多采挖根茎用来繁殖种苗。

4.1.3 生态适应性 适应性评价是衡量植物迁地保育成功与否的关键。药用植物引种驯化不仅需要保证种源可靠，还需要注意生态环境在驯化过程中扮演的角色。温度和光照是影响植物生长的重要生态因子。Karuppaiya 等[31]研究表明，低温下调控八角莲鬼臼毒素合成的基因表达量上调，促进了鬼臼毒素在根茎的积累。在低温（4～6 ℃）条件下生长的八角莲的生物量和叶绿素、类胡萝卜素、鬼臼毒素含量均高于在25～30 ℃温室大棚生长的八角莲。Zhao 等[32]研究不同光照强度（10%、30%、50%、100%自然光）对八角莲形态性状、物质分配、光合作用及其活性成分积累的影响发现，随着光照强度的增加，植株变矮，叶片变小，而在盛夏（7 月）日照充足（100%自然光）的情况下叶片受损严重；在过度光照导致叶片死亡后，8 月会长出新叶，而在其他3 种光照下生长的植株则表现出旺盛的绿叶；在30%自然光照射下，叶片为暗绿色；光照强度对八角莲总生物量无显著影响，且4 种光照强度梯度下的物质分配模式相似，生物量平均有85%分配给了地下器官（根茎），其余15%分配给了地上植物部分；30%自然光光照强度下，八角莲表现出最佳的营养生长和光合作用能力，鬼臼毒素积累量较高。因此，八角莲是一种能够很好地适应光照变化的耐阴植物。在八角莲的引种栽培和回归保育实践时，建议将光照强度设置为10%～50%自然光，尤其是30%自然光。

4.2 种苗繁育

八角莲的种苗繁育方式通常有种子繁育、根茎繁育和组织培养繁育3种方式。

4.2.1 种子繁育 种子繁殖是八角莲最原始的繁殖方式。其种子在自然条件下具有休眠期长的生理特性。刘燕琴等[17]认为，种皮和胚乳制约、种子生理后熟是引起八角莲种子休眠的主要原因，用400 mg·L-1赤霉素（GA3）溶液浸种24 h 或6～7 ℃低温层积均能在一定程度上解除休眠，促进萌发。其中，以6～7 ℃低温层积150 d 效果较好，发芽率和发芽势分别达到88.5%和30.4%。贮藏条件和方式也是影响种子活力的重要因素。研究表明，对种子进行砂藏可以提高种子的发芽率[33]。虽然，通过激素处理和低温层积可以在一定程度上解除休眠、促进萌发，但据八角莲有性繁殖的初步研究发现，自然情况下八角莲坐果率低于8%，而成熟的八角莲果实在5%以下，果实内仅含有效种子4～6 粒[33]。由于八角莲存在自交不亲和障碍，自然状态下结实率低下，可用于育苗的种子量有限成为八角莲种子育苗的瓶颈问题。对于异花授粉植物，人工授粉是提高其结实率的重要途径。刘燕琴等[34]经过多年的研究，认为采用人工授粉方法可以提高八角莲种子结实率。但人工授粉费时费工、效率低下，依然无法满足规模化育苗的需求。

4.2.2 根茎繁育 根茎繁殖是部分根茎类植物的繁殖方式，具有出苗率高、不容易发生徒长、生长势和抗逆性较强、可较好保持品种种性等优点。八角莲根状茎先端结节每年可形成1 个幼芽，第2～3节上有芽苞，当受外界创伤或人为切割时，可促使其节上芽苞萌发，长出新苗，而其后的结节则逐渐老化，再生能力很弱。因此，可利用八角莲先端的1～3 节进行无性繁殖。我国华中地区一般在7 月下旬至8 月上旬（西南地区一般2—3 月[35]）采挖八角莲根茎，切下其第1～3 个结节作繁殖材料，随采随栽。可在畦面上横向开沟条播，行距20 cm，播幅10 cm，沟深3～4 cm，在沟内按每隔8～10 cm种上1 个芽苞，用火土灰盖种，充分浇水后覆草保温保湿[24]。但由于目前八角莲资源量稀少，加之其根茎只有长在前端的2 个圆盘节具有分生能力，后面的圆盘节木质化严重，无再生能力，利用其根茎进行规模化育苗困难很大。此外，八角莲的药用部分主要是根茎，为了不浪费其药用部分，须要考虑利用其他非药用部位来代替根茎进行育苗。韦蓉静等[36]尝试用根茎根代替根茎繁殖，但经对比，根茎根的成苗率仅为38%，比根茎育苗法成苗率低64%。刘燕琴等[37]开展了茎节育苗不同播种时间、不同生长年限茎节出苗特点的研究，对多年生茎节采用药剂处理法，筛选合适的激素组合、浓度，促进了多年生茎节的出苗率；同时，对多年生茎节采用药剂处理合并室内砂藏处理能较好地促进其萌芽，提高了茎节的出苗率。该研究组在对须根播种方法、材料规格、播种时间等研究的基础上，对须根药剂处理的激素组合进行了筛选，并采用合适的药剂处理、室内河沙低温层积等方法有效促进了须根苗的分化、出苗。徐铭泽等[38]采用正交法，对根状茎结节进行浸泡之后，将根状茎栽入培养土中，再用对应的激素水溶液代替自来水进行培养，结果发现，选取根状茎第1 节结节，1.0 mg·L-16‑苄氨基腺嘌呤（6‑BA）+0.2 mg·L-1苯基噻二唑基脲（TDZ）激素水溶液中浸泡24 h，不定芽诱导效果最好，每个根状茎诱导的不定芽数可达5～7 个，表明用激素水溶液对八角莲根状茎进行浸泡预处理和浇灌，能显著提高八角莲不定芽的产量。

4.2.3 组织培养繁育 Jiang 等[39]于2012 年成功建立了八角莲的高效组织离体快繁技术体系。该方法以八角莲的根茎上的嫩芽为外植体，接种在MS+1.0 mg·L-16‑BA+0.5 mg·L-1GA3+0.5 mg·L-1玉米素（Zea）培养基上6 周后，可直接分化出多个不定芽而不经过愈伤组织阶段；以叶片为外植体，接种在MS+0.5 mg·L-1萘乙酸（2,4‑D）+0.2 mg·L-16‑BA培养基上4 周内即可诱导出愈伤组织，愈伤组织在MS+1.0 mg·L-16‑BA+0.2 mg·L-1TDZ 培养基上6周内可分化出不定芽；且从根茎的嫩芽和愈伤组织分化获得的不定芽在1/2 MS+0.5 mg·L-1吲哚丁酸（IBA）+0.5 g·L-1活性炭（AC）培养基上培养4周，生根率可达100%；在蛭石‑土壤（1∶1）的基质中炼苗后移植到田间，成活率达85%。八角莲离体组织培养体系的建立为濒危植物八角莲开辟了新的繁育途径。该方法外植体用量少、短时间内可繁殖大量种苗且对母体植株无损伤，弥补了种子繁殖和根茎繁殖的缺点，对濒危植物八角莲的迁地保护意义深远。中国医学科学院药用植物研究所广西分所科研人员总结了八角莲的组织培养繁殖方法，并制定了适用于广西境内八角莲种苗规范化生产的八角莲组培苗生产技术规程[40]。利用此组织培养方法，组培苗种子诱导率为85.2%，组培苗生根率达85%以上，但有少量组培苗出现褐化，需进一步对其进行防褐化试验研究。在对药用植物的迁地保护过程中，活性成分的变化仍是备受关注的问题。比较八角莲愈伤组织和组织培养品及野生品中鬼臼毒素含量，发现八角莲的组织培养品与野生品所含化学成分类型基本相同，但有效成分鬼臼毒素含量远低于野生品[41‑43]。八角莲为多年生药用植物，主要以地下根茎入药，但其根茎呈结节状，每年长1 节，数年才能入药用。育苗移植的八角莲要8 年以上才能收获，生产周期较长[22]。鉴于此，八角莲组培苗移栽到野外生长数年后药用成分含量是否能恢复到原野生品的水平还需要进一步深入全面的研究。

4.3 种质资源保存

目前，八角莲种质资源保存主要有活体植株保存、种子保存及离体组织器官保存3 种方式。活体保存主要以种质圃栽培保存为主。四川省自然资源科学研究院熊铁一等[44]收集了150余份野生八角莲居群材料，建立了独立的研究用八角莲种质资源圃。在种子保存方面，刘燕琴等[33]研究发现，从9月开始进行4 ℃冰箱低温贮藏，到次年2 月，八角莲种子发芽率为0，说明八角莲种子低温贮藏技术还有待进一步研究。因未进行种子湿度管理，种子室内砂藏法出苗率低于50%。而室内砂藏保湿法的温度、湿度能得到较好的控制，促进了种子后熟，有效保持了种子活力，种子发芽率较高，出苗率可达90%。随着八角莲植物组织培养技术的日渐成熟，也可通过离体组织培养技术保存种质资源。离体材料每隔一段时间（常规时间为1～2 个月）进行继代培养以保存种质资源，但组织培养保存法存在遗传材料变异的风险[45]。

5 回归保育

回归保育也称再引入，是将人工繁殖体重新放回适合其生存的野生环境中去，重建较为完善的生态系统，提高生态系统生物多样性及群落稳定性，建立可自我维持的种群的保育方式[46]。八角莲的回归保育需根据其生长发育规律、野生原种适生环境及濒危原因制定适宜的回归保育方案。

5.1 回归保育的类型

回归保育主要有增强回归、重建回归和引种回归3种类型[47]。增强回归是在原有种群的基础上，通过回归增加物种数量；重建回归即在生境中原有分布，但已经消失了，其目的是通过种群的释放与管理，扩大物种的分布范围；引种回归是把物种回归到合适的生境中，而不清楚该生境原来是否有回归物种的分布[48]。由于八角莲地理分布较广，遍及我国16 个省、自治区和直辖市[49]，只是有些分布区原有种群数量减少或整个种群已消失。因此，可通过增强回归在原有种群的基础上增加八角莲种群数量；通过重建回归重新释放一些八角莲群体，回归到原种群已消失的分布区，恢复原有八角莲分布范围。考虑到资金和人力投入，对于主要分布区的八角莲种质资源只需要限制乱采乱挖现象、保证现有资源正常更新和繁殖即可。

5.2 回归适宜区域的选择

长期的自然驯化使八角莲形成了喜阴湿环境、忌强光和干旱的生长特性，其生长在山谷、山坡常绿阔叶林、落叶阔叶林或竹林下阴湿处，透射光强度10%～50%，以30%的透光率下生长为最优[39]。由于八角莲的自交不亲和特性，在野外自然状态下主要通过昆虫传粉受精进行后代繁殖。因此，在充分考虑八角莲适生环境的前提下，应尽量选择传粉昆虫活动频繁的区域，或在该生境下通过放养传粉昆虫。为了便于八角莲回归保育的实施及后期的管理和监控，最好选在国家或各地方自然保护区、国有林场等区域内。

5.3 种苗繁育及要求

药用植物在回归保育时要尽量保留其野生原种的生物学特性及其药效遗传特性。虽然，通过种子繁殖、根茎繁殖和组织培养繁殖3 种繁殖方式都可以获得八角莲实生苗，但由于回归野外除种苗用量大外还要求能较好地保持其遗传特性。八角莲本身产生种子数量有限，且种子存在休眠期，繁殖多代后会发生种性退化和种质变异现象，不能完全保证其野生原种的生物学特性及其药效特性。根茎繁殖对母体植株有一定损伤性，且不能满足生产大量种苗的要求。因此，建议通过离体组织培养的方式来获得八角莲回归种苗。种源须为野生原种，苗木须健壮无病虫害，以保证种苗具备一定的野外条件生长能力，同时也可避免对回归生境的危害。组培苗的继代次数不能太多，若在人工条件下已经繁殖多代则有可能导致其繁殖和自卫能力降低，从而难以适应野外恶劣的环境而无法生存。回归所用组培苗按《八角莲组培苗生产技术规程》（DB45/T 1031—2014）[40]的要求生产。组培苗炼苗15 d 后，移栽于泥炭土‑珍珠岩（1∶1）混合的苗钵中，在遮阴棚下生长30 d后即可移栽回归至野外[26]。

5.4 移栽回归

移栽时间在春、夏、秋季均可，以春季为最佳。具体可按参考文献[26]和《八角莲栽培技术规程》（LY/T 2952—2018）[27]进行。

5.5 后期管护与监测

定植后如无降雨，可进行人工浇水。要保持土壤湿润透气。同时，注意排水，以防根系外露和烂根现象的出现。此外，也要意适时培土。为了满足其生长发育的需要，在定植后，还要适时摘蕾、追肥[27]。待植株健壮生长后每隔半年或1年须去实地查看，及时清除缠绕在植株上的枝蔓及其他威胁八角莲生长的不利因素。

6 讨论

一系列内因（自交不亲和现象、遗传多样性低、自然状态下结实率低）和外因（野生资源的过度采挖、生长环境的破坏）的共同作用加剧了药用植物八角莲的濒危程度。为实现对其资源的可持续利用，对药用植物八角莲的保育学研究与实践势在必行。

药用植物的保育不同于一般植物的保育，不仅要保护其野生原种免于濒危或灭绝，还要注意保持其药效不丧失。保护物种需要研究种群的生活条件和干扰对其生存能力的影响，保护药效需要研究药效成分动态积累及各种环境和遗传因子对成分积累的影响[50]。通过就地保育可实现对八角莲原始种群及生境的有效保护，从而为迁地保育的原始材料来源提供保障，为回归保育的生境选择提供实体参考。通过迁地保育能方便研究八角莲的遗传、繁殖、生长发育规律，提取其有效成分，研究其药效的形成与维持规律。这些规律对八角莲的药效保护起基础支持作用。药用植物需要在特定环境下才能合成或积累药用活性成分，有些药用植物离开原生境其药效也会下降或消失。所以，还需通过回归保育将人工繁殖体重新放回适合其生存的野生环境中去，增加八角莲野生种群的数量，扩大野生资源分布范围，重建较为完善的生态系统，提高生态系统生物多样性及群落稳定性，使其“源于自然，归于自然”。此外，为保护八角莲现有种群和将来回归种群的生长和正常繁殖，地方政府和国家相关部门应加大对其分布区的监管力度，巩固八角莲保育成果，最终实现对八角莲资源的可持续利用。最后，还需关注八角莲保育效果，如所制订保育策略实施一段时间后，对其分布区域、蕴藏量、年允采量、市场供应量等是否增加，是否能保持其原有的遗传特征、化学特征和药效特征等进行评价和反馈。