基于网络药理学与分子对接探究宁心通郁滋肾方治疗早发性卵巢功能不全的作用机制

马佳文 李想 张翼宙

浙江中医药大学 杭州 310053

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是女性常见的内分泌疾病，是指40岁之前出现卵巢功能减退，临床表现为月经稀发甚至闭经，严重者影响育龄期女性的生育能力[1]。POI在一般人群中的发病率为1%[2]，由于女性工作与生活压力的增大，近年来POI的发病率上升至3.7%[3]，上升趋势明显。POI如不及时治疗，将发展为卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），此时卵巢功能衰竭，将出现绝经、生殖器官萎缩等绝经期表现[4]，且无法逆转。因此，POI的治疗具有重要的临床意义。

西医临床治疗POI一般采用激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）[5]，但世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单提示，雌激素-孕激素更年期治疗（合用），以及雌激素-孕激素口服避孕药（合用）均属于1类致癌物。由此可见，该疗法存在不容忽视的致癌隐患。中医学则从“天癸即元阳”和“肾主生殖”等整体思路出发，多靶点协同治疗改善卵巢功能。中医妇科经典著作《傅青主女科》记载了“年未老经水断”的病证，采用“必须散心之郁，而大补其肾水”[6]的益经汤治疗。本研究团队以《傅青主女科》益经汤为基础，化裁出宁心通郁滋肾方，研究发现该方对POI患者有较好的临床疗效，但其作用的药效物质基础尚不明确，活性成分及关联性未知，这在一定程度上限制了该方的推广使用。本研究基于四级杆-静电轨道阱（Q exactive orbitrap，Q-Orbitrap）高分辨液质联用系统分析结果，采用网络药理学方法对宁心通郁滋肾方治疗POI的活性成分和作用靶点进行筛选，结合分子对接技术，为深入研究宁心通郁滋肾方的作用机制及药效物质基础提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 仪器 Q Exactive高分辨质谱仪和UltiMate 3000 RS均购于赛默飞世尔科技有限公司；Direct-Q®5纯水/超纯水一体机系统购于德国默克密理博公司；D3024R型高速微量冷冻离心机为北京大龙兴创实验仪器有限公司产品；MTV-100多管涡旋混合仪购于杭州奥盛仪器有限公司。

1.2 试剂 中药材包括熟地黄、龟板、党参、山药、酸枣仁、柴胡、菟丝子、当归、白芍、丹皮等，均购于浙江中医药大学附属第三医院（批号：20210701、20210827、210601、210701、20210801、210201、20210501、20210702、20210801、20210801）；色谱纯甲醇购于赛默飞世尔科技有限公司；色谱纯甲酸购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 Q-Orbitrap高分辨液质联用分析

1.3.1.1 质谱条件和色谱条件 （1）质谱条件：Q Exactive高分辨质谱仪以电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）为离子源，采用正负离子切换的扫描方式。检测方式采用full mass/dd-MS2，设置分辨率为70 000（full mass）和17 500（dd-MS2），扫描范围为150.0～2 000.0 m/z。电喷雾电压为3.8 kV，毛细管温度为300℃。碰撞气采用高纯氩气；鞘气采用氮气，体积流量为40 Arb；辅助气采用氮气，温度为350℃。数据采集时间为30 min。

（2）色谱条件：色谱柱为Welch XB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）为流动相，色谱梯度为0～1 min，98%A；1～5 min，80%A；5～10 min，50%A；10～15 min，20%A；15～20 min，5%A；20～25 min，5%A；25～26 min，98%A；26～30 min，98%A；流速为0.30 mL/min；柱温箱温度为35℃；自动进样器温度为10℃；进样体积为5 μL。

1.3.1.2 上样溶液的制备 宁心通郁滋肾方由熟地黄30 g、龟板12 g、党参12 g、山药15 g、酸枣仁12 g、柴胡6 g、菟丝子12 g、当归15 g、白芍12 g、牡丹皮9 g组成。加入8倍质量的单蒸水，覆盖药面浸泡30 min，大火煮沸后，小火煎煮40 min，滤出药液，第2次煎煮法与第1次相同，最后将两次药液混合进行浓缩，获得宁心通郁滋肾方水煎液。取水煎液200 μL，加入80%甲醇溶液1 mL，涡旋10 min。4℃下20 000r/min离心10 min，取上清液并过滤。

1.3.1.3 数据分析 Q-Orbitrap高分辨液质联用采集的数据通过Compound DiscovererTM2.1软件完成初步整理后，在mzCloud数据库进行检索比对，构建宁心益肾方水煎液成分数据库。

1.3.2 网络药理学分析

1.3.2.1 宁心通郁滋肾方活性成分筛选及潜在靶点预测 通过Q-Orbitrap高分辨液质联用分析，构建宁心益肾方水煎液成分数据库，筛选出mzCloud数据库匹配丰度（mzCloud best match）≥80的化合物。通过PubChem查找化合物的2D结构，并导入Swiss ADME数据库（http://www.swissadme.ch/）[7]。 初步限定化合物的肠胃吸收度为“High”，以此筛选具有较好生物利用度的活性化合物。再者，筛选五种类药性（Lipinski、Veber、Ghose、Egan、Muegge） 中有2个及以上为“Yes”的化合物，即为宁心通郁滋肾方中的活性成分。通过Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测活性成分对应的药物靶点。可能性（Probability）＞0的靶点即为宁心通郁滋肾方的药物靶点。

1.3.2.2 POI疾病靶点筛选 通过基因组注释数据平台（Genome Annotation Database Platform，GeneCard）（https://www.genecards.org/）和在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM） 数据库（https://www.omim.org/）得到与POI相关的疾病靶点，并与宁心通郁滋肾方的药物靶点相匹配，获取交集靶点。利用Cytoscape 3.8.2软件构建宁心通郁滋肾方活性成分-交集靶点网络图。

1.3.2.3 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建 将药物与疾病的交集靶点导入String数据库（http://string-db.org/cgi/input.pl），物种选择为“Homo Sapiens”，置信度设定为0.7，从而构建PPI网络。 将结果导入Cytoscape 3.8.2软件，借助Cyto NCA中的度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、网络中心性 （network centrality，NC）、 局部边连通性（local average connectivity，LAC）等6个参数筛选节点，选取网络连接度≥2倍中值的节点为关键靶点[8]。将关键靶点与活性成分对应的结果导入Cytoscape 3.8.2软件，依据度值筛选出宁心通郁滋肾方治疗POI的关键活性成分，构建“关键靶点-关键活性成分”网络。

1.3.2.4 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 通过生物学信息注释数据库（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/）[9]，对关键靶点进行GO分析和KEGG富集分析，获取相关的生物学信息，从而分析宁心通郁滋肾方治疗POI的可能作用机制。

1.3.3 分子对接 将1.3.2.3中筛选出关键靶点和关键活性成分依据度值降序排列。选取前8位的关键活性成分分别与该成分靶向的、且度值排序前10的关键靶点进行分子对接，以此验证成分-靶点之间的相关性。 在UniPort（https://www.uniprot.org/）、RCSB蛋白数据库（RCSB Protein Data Bank，RCSB PDB）（https://www.rcsb.org/）、ZINC数据库（http://zinc.docking.org/）[10]中获取成分和靶点的三维结构，利用SYBYL-X 2.1.1软件中的Surflex-Dock进行分子结构对接，获取对接分数（total score）。

2 结果

2.1 Q-Orbitrap高分辨液质联用分析结果 本研究采用Q-Orbitrap高分辨液质联用进行成分分析，中药复方水煎液的总离子流图见图1。相关结果在mzCloud数据库匹配到812个化合物，依据mzCloud数据库匹配丰度降序排列。见表1。

表1 宁心通郁滋肾方水煎液成分表Tab.1 Ingredients of the water extract of Ningxin Tongyu Zishen Formula

2.2 网络药理学分析结果

2.2.1 宁心通郁滋肾方活性成分及其靶点 选取宁心通郁滋肾方水煎液中mzCloud数据库匹配丰度≥80的化合物共113个，根据生物利用度及五种类药性的限定，最终确定符合标准的中药活性成分71个。通过Swiss Target Prediction数据库共查询到相关靶点7 185个，满足条件靶点共3 734个，筛选去重后获得药物靶点共807个。

2.2.2 宁心通郁滋肾方活性成分-交集靶点网络图通过Gene Card和OMIM数据库共获得1 143个疾病靶点，将这些疾病靶点与药物靶点相匹配，共获得交集靶点176个。利用Cytoscape 3.8.2软件绘制宁心通郁滋肾方活性成分-交集靶点网络图。见图2。

图2 宁心通郁滋肾方活性成分-交集靶点网络图Fig.2 The active component-intersection target network of Ningxin Tongyu Zishen Formula

2.2.3 PPI网络构建及分析 将176个交集靶点导入String数据库，依据限定条件构建PPI网络，共得到176个节点，2 904条边。见图3A。将结果导入Cytoscape 3.8.2软件进行筛选后，共获得关键靶点39个，并依据度值进行排序。见图3B、C。这39个关键靶点即宁心通郁滋肾方治疗POI的关键靶点。将关键靶点与对应化合物导入Cytoscape 3.8.2软件进行网络构建，共获得55种关键活性成分。见图4。依据度值降序，前8种关键活性成分认定为主要关键活性成分，分别为槲皮素（Quercetin）、 异鼠李素（Isorhamnetin）、 瑟丹内酯（Sedanolide）、咖啡酸（Caffeic acid）、柚皮素（Naringenin）、 罗汉松脂素（Matairesinol）、 阿魏酸（Ferulic acid）、棕榈油酸（Palmitoleic acid）。

图3 PPI网络及关键靶点筛选图Fig.3 PPI network and the key target screening map

图4 关键靶点-关键活性成分网络图Fig.4 key target-key active component network

2.2.4 GO分析 将宁心通郁滋肾方治疗POI的39个关键靶点导入DAVID数据库进行GO分析，以P＜0.05为筛选标准，对GO分析获取的生物学过程（biological process，BP）、细胞组 分 （cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）的数据分别进行升序排列，并选取其中排名前15位者绘制富集气泡图。见图5。结果显示，宁心通郁滋肾方主要通过细胞液（cytosol）、细胞质（cytoplasm）、核质（nucleoplasm）、蛋白复合体（protein complex）、细胞核（nucleus）等细胞组分参与凋亡过程的负调控 （negative regulation of apoptotic process）、一氧化氮生物合成过程的正调控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、蛋白磷酸化正调控（positive regulation of protein phosphorylation）、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、转录的正调控-DNA模板（positive regulation of transcription-DNA-templated）等生物过程，发挥酶结合（enzyme binding）、转录因子结合（transcription factor binding）、相同蛋白结合（identical protein binding）、激酶活性（kinase activity）、蛋白结合（protein binding）等分子功能，起到改善卵巢功能，治疗POI的作用。

图5 宁心通郁滋肾方治疗POI靶点GO分析Fig.5 GO analysis of targets of Ningxin Tongyu Zishen Formula in the treatment of POI

2.2.5 KEGG富集分析 通过DAVID数据库对39个关键靶点进行KEGG富集分析，得到具有统计学意义（P＜0.05）的通路共111条，以P值为依据，选取前20条进行通路分类汇总。见图6。由图中可知，39个关键靶点主要富集在癌症通路（pathways in cancer）、癌症中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、乙型肝炎（hepatitis B）、前列腺癌（prostate cancer）、缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、甲型流感（influenza A）、胰腺癌（pancreatic cancer）、催乳激素信号通路（prolactin signaling pathway）、黏附斑（focal adhesion）、叉头蛋白O（forkhead box O，FoxO）、甲状腺激素（thyroid hormone）、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositide 3-kinases-protein kinase B，PI3K-Akt）等信号通路。依据此20条信号通路的分子相互作用、反应和关系网络，可分为人类疾病（human diseases）、生物系统（organismal systems）、环境信息处理 （environmental information processing）、细胞进程（cellular processes）共四大类。

图6 宁心通郁滋肾方治疗POI靶点KEGG富集通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis of targets of Ningxin Tongyu Zishen Formula in the treatment of POI

2.3 分子对接结果 采用Surflex-Dock分子对接程序，将2.2.3中所述主要关键活性成分分别与靶向相关且度值排序前10的关键靶点进行分子对接，从而获得对接分数（total score）。见图7。对接分数代表配体与靶蛋白受体结合的稳定性，分数越高则稳定性越好。当对接分数＞5分时，提示分子与靶点蛋白的结合度较好。槲皮素是宁心通郁滋肾方的主要活性成分，其与对应关键靶点的对接分数均＞5，说明均有较好的结合稳定性，分子对接图见图8。

图7 关键成分与关键靶点对接结果热图Fig.7 Heat map of docking results between key components and key targets

图8 槲皮素与关键靶点分子对接图Fig.8 Molecular docking of quercetin with key targets

3 讨论

POI所表现出的卵巢功能衰退是一个渐进的过程，因此在疾病早期就应给予高度重视。2016年欧洲人类生殖与胚胎学会明确了POI的定义，并强调要采取必要的干预，以延缓病情发展至卵巢功能衰退的终末阶段，即POF[2]。由于POI的病因复杂，发病机制尚不明确，故尚未研发出治疗该病的特效药物。本研究团队自拟宁心通郁滋肾方，用于临床治疗POI，取得了良好的疗效，但该方剂的作用机制尚不明确。由于中药复方成分复杂，所以探明宁心通郁滋肾方治疗POI的作用机制存在一定的困难。网络药理学具有整体性与系统性的特点，能够从分子层面探究中医药治疗疾病多成分、多靶点、多途径的作用机制，近年来已被广泛应用于中药复方的研究[11]。本研究采用网络药理学分析结合分子对接的方式，为探究宁心通郁滋肾方治疗POI的作用机制提供思路。

Q-Orbitrap高分辨液质联用分析结合网络药理学研究结果表明，宁心通郁滋肾方治疗POI的活性成分包括槲皮素、异鼠李素、瑟丹内酯、咖啡酸、柚皮素等。依据分子对接结果，其中主要活性成分槲皮素与磷酸肌醇3激酶调控亚基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、类固醇受体共激活因子（steroid receptor coactivator，SRC）等关键靶点的对接均较稳定，可能在POI的治疗中起到关键作用。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等多种药理活性[12]。研究表明，槲皮素能够通过抑制PI3K-AKT途径，下调AKT的表达，从而抑制原始卵泡的过度激活，防止卵泡池的提前耗竭[13]。虽然目前尚未证实槲皮素能够通过PIK3R1、EGFR、SRC影响卵巢功能，但已有研究表明，槲皮素能够对PIK3R1、EGFR、SRC的表达产生影响，例如槲皮素能够与PIK3R1结合并抑制其活性，从而缓解慢性肾功能衰竭大鼠的肾纤维化[14]；也能够通过下调EGFR的表达，抑制人乳腺癌细胞株T47D的增殖，促进其凋亡[15]；槲皮素作为毛茛甲醇提取物中的主要活性成分，还能够靶向作用于SRC，发挥抗炎活性[16]。槲皮素是否通过PIK3R1、EGFR、SRC对卵巢组织发挥同样作用，值得进一步验证。

PPI网络构建及分析提示，信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）、SRC、AKT1、90kDa 热休克蛋白αA19（heat shock protein 90kDa αA1，HSP90AA1）、促分裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、EGFR等39个靶点可能是宁心通郁滋肾方治疗POI的关键靶点。其中，STAT3的度值最高，可能在治疗中起到非常关键的作用。STAT3是一种细胞内信号转录因子，能够参与免疫反应、调节细胞周期和影响细胞存活。研究表明，在猪卵巢颗粒细胞中上调STAT3的表达能够抑制细胞凋亡，而促进细胞增殖[17]；STAT3还参与炎症反应，当发生炎症反应时，STAT3的磷酸化水平上升[17]。以上结果提示，上调STAT3表达或抑制STAT3的磷酸化水平也许有助于卵巢功能的改善。

对39个关键靶点进行GO和KEGG富集分析后发现，它们可能参与调控癌症通路、癌症中的蛋白聚糖、乙型肝炎、前列腺癌、HIF-1、甲型流感、胰腺癌、催乳激素信号、黏附斑、FoxO等信号通路，以及凋亡过程的负调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、蛋白磷酸化正调控等生物过程，发挥酶结合、转录因子结合、相同蛋白结合等分子功能，从而治疗POI。FoxO是重要的调节因子，参与细胞代谢、细胞增殖、DNA修复、自噬、氧化应激等多种细胞内过程[18]。该因子在细胞中广泛表达，在哺乳动物细胞中FoxO家族共有4个成员：FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6。其中，FoxO1作为活性氧（reactive oxygen species，ROS）的感受器，参与不同水平的氧化应激调控[19]。FoxO1表达的上调会导致卵巢颗粒细胞的凋亡[20]。此外，它还能够通过激活肿瘤蛋白53诱导的核蛋白1-肿瘤蛋白p53-细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（tumor protein 53-induced nuclear protein 2-tumor protein p53-cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，TP53INP1-p53-CDKN1A）通路，从而诱导卵巢颗粒细胞发生细胞周期阻滞[21]。而FoxO3a作为沉默信息调节因子1（sirtuin 1，SIRT1）的氧化还原靶分子，能够参与卵巢的氧化应激调控[22]。

现代女性面对来自生活、工作、社会等各方面的压力，身体处于慢性应激状态，这也许是导致卵巢功能提前衰退的重要因素[23]。持续的慢性应激影响会诱使卵巢内ROS水平上升，氧化与抗氧化平衡失调，引起氧化应激反应[24]。氧化应激会促使卵巢颗粒细胞内炎性因子的释放，促发炎症反应[25]；同时也通过破坏细胞成分，或激活凋亡相关信号通路，导致卵巢颗粒细胞凋亡[26]。由于卵巢功能的发挥依赖于卵巢颗粒细胞的正常生长分化[5]，因此缓解氧化应激所致的一系列反应或许是治疗POI的关键。

综上所述，本研究基于Q-Orbitrap高分辨液质联用分析，以及网络药理学与分子对接技术，发现宁心通郁滋肾方可能通过槲皮素、异鼠李素、瑟丹内酯、咖啡酸、柚皮素等关键活性成分，作用于对应的关键靶点，通过缓解氧化应激、修复氧化损伤、抑制卵巢颗粒细胞凋亡、促进卵巢颗粒细胞增殖等机制改善卵巢功能，延缓卵巢的衰退，从而治疗POI。本研究结果为进一步研究宁心通郁滋肾方治疗POI的作用机制提供了方向与思路。