转染过表达WWOX 质粒的胆囊癌细胞株GBC-SD迁移、侵袭能力变化及其机制

房立锐，魏东，雷学芬，佟鑫，徐冬杏，张文

1 昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科，昆明650000；2 昆明医科大学第二附属医院肿瘤科；3 云南省第三人民医院肾病科

原发性胆囊癌是一种起源于胆囊黏膜上皮的胆道系统最常见的恶性肿瘤，在全世界范围内发病率居消化道肿瘤的第六位，多见于女性和老人［1］。胆囊结石、慢性胆囊炎、胆囊息肉、胆囊腺瘤、胆囊腺肌增生症、肥胖等因素是胆囊癌的主要病因［2］。目前原发性胆囊癌首选的治疗方法仍为早期手术治疗。由于胆囊癌早期症状不明显和缺乏常规的敏感筛查测试，胆囊癌早期诊断困难，且肿瘤进展迅速，超过50% 的胆管癌和胆囊癌在晚期才被诊断，此时大多数患者已经出现远处转移或淋巴结转移，失去手术机会，只有小部分患者能进行根治手术治疗［3-4］，且晚期患者预后极差，胆囊癌患者平均生存时间仅10个月，5 年总生存率不足5%，胆囊癌的术后复发和侵袭转移是胆囊癌患者的主要致死原因［5-6］。所以，探究胆囊癌的合适治疗靶点对于临床治疗极为迫切。自从1979 年发现P53 以来，随着其作为肿瘤抑制因子的功能变得明显，P53 一直是肿瘤生物学关注的焦点，P53 是人类癌症中最常发生突变的基因［7］。P73 是P53 抑癌基因家族的一员，但P73 在癌症中几乎没有突变，在结构和功能上与P53 有很大的同源性，其可反式激活P53 反应基因并介导DNA损伤反应［8-10］，但其确切机制尚不清楚。WW 域的氧化还原酶（WWOX）是2000 年由BEDNAREK 等在染色体的普通脆性位点FRA16D 区域克隆出的新抑癌基因，WWOX位于染色体的16q23. 3～24. 1区域，跨越超过1. 11 MbP 的基因组区域。WWOX 蛋白有414 个氨基酸，相当于一个46 kda 的蛋白质。WWOX 蛋白，也被称为WOX1 或FOR（一种含有氧化还原酶的WW 结构域），是一种肿瘤抑制因子［11-13］，WWOX 蛋白与许多调控因子相互作用以调节细胞凋亡和增殖。前期我们的实验研究发现，WWOX 的表达在胆囊癌组织中明显下降，且过表达的WWOX 可以抑制胆囊癌细胞的增殖并促进其凋亡；在多种肿瘤中如大肠癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、前列腺癌等中也同时发现WWOX 基因有抑癌作用，在大多数研究的癌症类型中，WWOX 表达的沉默与更晚期的肿瘤、更高的侵袭性、更差的患者总体生存率有关。为了确定WWOX 是否在P73介导的抑制肿瘤的侵袭转移过程中发挥作用，2019年12月1日—2021 年9 月1 日，我们的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1. 1 细胞、转染质粒及试剂 胆囊癌细胞株GBCSD 由昆明动物研究所动物细胞库提供。WWOX 过表达质粒、Lenti-PacTMHIV 慢病毒包装试剂盒均购自广州GenecoPoeia 公司。RPMI1640 培养液购自美国HyClone 公司，胎牛血清购自美国Gibco 公司，BCA蛋白定量试剂盒为上海碧云天生物技术研究所产品，E-cadherin、Vimentin、P73 兔抗人单克隆抗体均购自杭州华安生物技术有限公司，WWOX 兔抗人单克隆抗购自Proteintech 公司，Transwell 试剂盒购自BD公司。

1. 2 细胞培养、分组及质粒转染 佩戴防护镜和无菌手套后，从液氮罐中取出装有冻存GBC-SD 细胞的冷冻管，迅速放入37 ℃恒温水浴锅中，并不时摇动，在1 min 内使其完全融化，然后在无菌条件下将解冻的细胞转移至10 mL 离心管，避免污染细胞，然后在1 000 r/min 速度下离心5 min，弃去上层液，加入2 mL 培养液吹打使底部沉淀（GBC-SD）细胞重悬后接种于培养瓶中，接种浓度约1×109/L，加入5 mL培养液后置37 ℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。待细胞长满培养瓶壁时，将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去；然后先用2 mL 的PBS 冲洗后加入1 mL 0. 25% 胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入胰蛋白酶液中盖好培养瓶盖后，置于37 ℃培养箱中3～5 min 后，待原贴壁的细胞逐渐趋于圆形并脱落时，加入5 mL 培养液终止消化，用移液枪将贴壁的细胞吹打成悬液，离心去胰酶后按照1∶2 比例传代后，置37 ℃下继续培养。取生长状态良好的GBC-SD 细胞分为实验组、NEG 组、空白对照组，继续传代培养2 次使细胞处于最佳状态后制成单细胞悬液，按9×104个/孔接种于12 孔板中，待细胞铺满培养瓶70%～80% 左右时，实验组转染WWOX 过表达质粒，NEG 组转染空载质粒，空白对照组不做处理。各组细胞转染12 h后更换完全培养液，72 h 后用含1 μg/mL 嘌呤霉素的完全培养液进行实验组和NEG 组稳定转染细胞的筛选，继续培养48 h，更换1～2次含嘌呤霉素的培养液，筛选转染成功的GBC-SD 细胞，收集细胞，用于后续实验。空白对照组用不含嘌呤霉素的完全培养基培养。

1. 3 各组细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。将三组细胞用胰蛋白酶消化为单细胞悬液。在6 孔培养板背面每隔0. 5 cm 画3 条横线，分别在每孔中按照2×105/mL 的密度加入细胞过夜，待细胞生长汇合度达80%～90% 时，将直尺垂直于培养孔背后的横线，用10 μL 无菌枪头沿直尺在培养板上做划痕，PBS溶液洗涤划下的细胞，重复洗3 次，在37 ℃、5% CO2环境中培养，在培养0、48 h 时分别取样拍照，使用Image J 软件分析划痕宽度变化，计算细胞迁移率，以细胞迁移率表示细胞迁移能力。细胞迁移率=（0 h 划痕宽度-48 h 划痕宽度）/0 h 划痕宽度×100%。实验重复3次，取平均值。

1. 4 各组细胞侵袭能力观察 采用Transwell 实验。于Transwell 板上室面铺ECM 胶50 μL，5 h 后，取对数生长期各组细胞，以2×105/mL 密度接种于Transwell 上室，下室加入含10% 胎牛血清的完全培养液600 μL，于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，再经甲醇固定，0. 1% 结晶紫染色后，用棉签刮除上室面ECM 胶，于200 倍显微镜下随机选取5 个视野观察并拍照，使用Image J 软件计数每个视野中穿过滤膜的细胞数，以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。

1. 5 各组细胞中WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin mRNA 检测 采用实时荧光定量PCR 法。用Promega 公司的RNA 小提试剂盒提取各组细胞的总RNA，将提取的总RNA逆转录成cDNA后，进行荧光定量PCR 检测。引物序列如下：WWOX 正向引物为5′-TCTCCTCAGAGTCCCATCG-3′，反向引物为5′-CTCCCAGACCCTCCAGTTC-3′；P73 正向引物为5′-GCCTGTCATCCCCTCCAAC-3′，反 向 引 物 为5′-AATTCCGTCCCCACCTGTG-3′；E-cadherin 正 向 引物为5′-GGCTGGACCGAGAGAGTTT-3′，反向引物为5′-GCTGTGGAGGTGGTGAGAG-3′；Vimentin 正向引物为5′-CAGAGAGAGGAAGCCGAAAACA-3′，反向引物为5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAGAC-3′；GAPDH 正 向 引 物 为5′-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3′，反 向 引 物 为5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR 的反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环。以2-ΔΔCt表示细胞中目的基因mRNA 的相对表达量。

1. 6 各组细胞中WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin蛋白检测 采用Western blotting 法。取三组细胞，RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂）裂解细胞并提取总蛋白，采用BCA 法进行蛋白定量，变性后进行SDSPAGE电泳分离，转移至PVDF膜，含5% 脱脂牛奶粉的TBST 溶液室温封闭2 h，加入WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin 一抗（按1∶500 稀释），4 ℃孵育过夜，第2天用TBS洗3次，每次5 min，随后室温条件下摇床孵育二抗，室温孵育1～2 h，然后ECL 显影，凝胶成像系统中曝光并拍照记录，用Image J 软件测量平均灰度值，以目的条带与内参β-actin 条带灰度值的比值表示WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin 蛋白的相对表达量。

1. 7 统计学方法 采用SPSS22. 0 统计软件。计量资料呈正态分布时以-x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组细胞迁移能力比较 实验组、NEG 组、空白对照组细胞迁移率分别为50. 42% ± 3. 47%、74. 81% ± 1. 04%、77. 82% ± 2. 71%，其中实验组细胞迁移率与NEG组、空白对照组相比，P均＜0. 05。

2. 2 各组细胞侵袭能力比较 实验组、NEG 组、空白对照组穿膜细胞数分别为（77. 33 ± 8. 65）、（173. 33 ± 6. 18）、（187. 33 ± 6. 94）个，其中实验组穿膜细胞数与NEG组、空白对照组相比，P均＜0. 05。2. 3 各组细胞中WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin mRNA 相对表达量比较 各组细胞中WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin mRNA 相对表达量比较见表1。 由 表1 可 知，实 验 组WWOX、P73、E-cadherin mRNA 相对表达量均高于NEG 组和空白对照组（P均＜0. 05），实验组Vimentin mRNA 相对表达量均低于NEG组和空白对照组（P均＜0. 05）。

表1 各组细胞中WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin mRNA 相对表达量比较（-x±s）

2. 4 各组细胞中WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量比较 各组细胞中WWOX、P73、Ecadherin、Vimentin 蛋白相对表达量比较见表2。由表2 可知，实验组WWOX、P73、E-cadherin 蛋白相对表达量均高于NEG组和空白对照组（P均＜0. 05），实验组Vimentin 蛋白相对表达量均低于NEG 组和空白对照组（P均＜0. 05）。

表2 各组细胞中WWOX、P73、E-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量比较（-x±s）

3 讨论

胆囊癌的侵袭转移一直是困扰患者及医生的重大难题，其侵袭和转移过程涉及上皮-间充质转化（ePithelial- mesenchymal transition，EMT）、局部侵袭、静脉内渗、循环运输、外渗、邻近及远隔部位的存活和增殖以及显性转移病灶的形成等多个复杂步骤，其机制繁琐复杂，其中EMT 在胆囊肿瘤的侵袭转移中起着不可忽视的作用。EMT 是上皮表型细胞向间充质表型细胞转化的一种细胞形态转化从而获得侵袭转移特性的过程，被认为是肿瘤进展和转移的关键调控因素。在此过程中，细胞失去粘附和极性，从而促进肿瘤细胞的侵袭性和向远处器官的扩散，主要的EMT 标记物包括上皮标记物如E-cadherin、cytokeratins 等，和间充质标记物如Vimentin、fibronectin、N-cadherin 等［14］。EMT 是肿瘤侵袭转移过程中的重要步骤，最近的研究［15-16］表明，EMT 有助于肿瘤血管生成，进而促进的侵袭转移。

WWOX 是一种重要的肿瘤抑制因子，可抑制多种肿瘤的增殖转移，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌等。我们课题组前期研究［17］表明，在胆囊癌细胞中WWOX 触发了其凋亡机制，在胆囊癌小鼠模型中，肿瘤的增殖受到抑制，靶组织中P73的表达上调，与阴性对照组相比，用WWOX 给药的小鼠模型预后更好。除胆囊癌外，WWOX 可以通过增强Elf5的活性来降低Snail1的活性，从而上调E-cadherin蛋白的表达并最终抑制卵巢癌的EMT，且WWOX基因可能通过调节EMT 调节因子Elf5 和Snail 的表达来逆 转 卵 巢 癌 干 细 胞 的EMT［18-19］。 在 乳 腺 癌 中，WWOX 失活导致p53 抑癌作用减弱，进而驱动基底样乳腺癌（BLBC）形成［20］。在肝细胞癌（HCC）中，WWOX 反义RNA 1（WWOX-AS1）通过miR-20b-5p/WWOX 轴抑制了HCC 的肿瘤发生，WWOX-AS1 上调与细胞增殖、迁移、EMT 过程减少和细胞凋亡增加有关［21］。本实验通过体外构建过表达WWOX 载体，形成WWOX 抑制胆囊癌EMT 的模型，进一步为探寻WWOX 相关靶基因在胆囊癌侵袭转移过程中的机制奠定基础。

与P53 不同，P73 很少发生突变。相关报道［9］指出，P73 通过增加Ago1/2 的表达来增强相关肿瘤的抗转移功能，这导致诸如let-7、miR-134、miR-130b、miR-449a、miR-181d 和miR-379 等miRNAs 的产生增加，这些miRNAs 可激活肿瘤抑制机制并抑制EMT、转移和肿瘤干细胞的细胞增殖。研究［22］显示，在黑色素瘤中P73 可通过调节酪氨酸酶进而影响其EMT 在口腔癌中，P73 限制EGF 诱导的EMT、侵袭性和干性［23］。我们的实验通过Western blotting、PCR 实验表明，在胆囊癌细胞中过表达WWOX可提高P73 的表达，致使胆囊癌细胞中EMT 间质标志物Vimentin 的表达下调、上皮标志物E-cadherin的表达上调，进而表明WWOX 可通过调控P73 抑制胆囊癌细胞的EMT。同时，本研究也通过Transwell小室实验验证了WWOX 可以通过调节P73 抑制胆囊癌细胞的侵袭转移，也进一步证明P73 可作为WWOX 的调控靶点之一。WWOX 在调控P73 抑制胆囊癌细胞EMT 从而抑制其侵袭转移的过程中起着不可忽视的作用，此实验可为胆囊癌的临床治疗奠定一定的基础，其中P73 是否为WWOX 的特异性靶点还有待进一步探究，WWOX 调控P73 在临床中的作用还需进一步通过临床实验进行验证。

综上所述，转染过表达WWOX 质粒的GBC-SD细胞株迁移、侵袭能力降低，其机制可能与P73表达上调进而抑制GBC-SD细胞的上皮-间充质转化过程有关，因此上调WWOX 进而增加P73 的表达可能成为胆囊癌治疗的新思路。