补肾活血方对子痫前期模型大鼠血栓前状态中凝血功能及TFPI-2的影响研究*

蔡晓晓 袁宁霞 张小菜 裴巧丽 王 丹 王 甜 朱丽红（陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000）

高龄孕产妇伴发妊娠期高血压及子痫前期相关领域的研究一直是产科热点［1-2］。血栓前状态（PTS）即是血液中凝血系统与纤溶系统失衡，引起血栓形成前的病理状态［3］。子痫前期患者一定程度上存在PTS，这种情况不一定引发血栓性疾病，但可能对子宫胎盘循环产生影响，从而引起胎盘灌注不足，导致胎盘微血栓形成。因此，失衡的PTS为抗凝治疗提供了理论基础。

子痫前期属于中医学“子肿”“子晕”“子痫”范畴。妊娠期间，阴血聚下以养胞胎，精血愈虚，阴不敛阳，相火偏旺，故本病因孕而虚，本虚标实。结合现代医学理论，PE患者全身小血管痉挛，胎盘等组织微血栓形成，导致部分组织坏死，故PE又属“瘀”的范畴。因此，肾虚血瘀是PE患者血栓前状态的中医病机关键。补肾活血原方来源于张锡纯《医学衷中参西录》，主要功用以补肾、安胎为主，加用丹参，祛瘀生新而不伤正，《本草纲目》谓其“能破宿血，补新血”；《妇科名理论》也有“一味丹参，功同四物”之说。补肾活血方所选用的桑葚、桑寄生、炒菟丝子、丹参、续断，旨在补肾化瘀的基础上补肾活血，研究补肾活血方高、中、低剂量对子痫前期模型鼠仔代发育的影响及胎盘组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）的表达。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由成都达硕动物实验中心提供的性成熟SD大鼠，雌鼠210～250 g，雄鼠250～280 g；动物合格证号：SCXK（川）2015-030。于室温18～28℃、相对湿度40%～70%的陕西中医药大学动物实验中心饲养。

1.2 药物与仪器 左旋亚硝基精氨酸甲酯（购于美国Sigma公司）；阿司匹林肠溶片（国药准字号H61023177，白鹿制药）；补肾活血方免煎颗粒（购于陕西中医药大学第二附属医院）。BP-100A全自动大小鼠无创血压测量仪（成都泰盟科技有限公司）；代谢笼（江苏动物实验设备有限公司）；电子显微镜（JEM-100SX）（日本电子公司）。

1.3 药物的配置 LNAME溶液［4］：用天平称取50 mg的L-NAME溶于1mL纯水中混匀，质量浓度为50mg/mL，玻璃棒搅拌使其完全溶解后4℃冰箱保存。阿司匹林肠溶片：按60 kg成人100 mg/d剂量计算，将50 mg阿司匹林肠溶片充分研磨成细颗粒状，加入0.9%氯化钠注射液50 mL，质量浓度为1 mg/mL，充分混匀后4℃保存。补肾活血方（桑葚10 g，桑寄生10 g，炒菟丝子10 g，续断10 g，丹参10 g）：免煎颗粒按低、中、高剂量分别溶于50 mL纯水中，其含生药量分别为1、2、4 g/mL。

1.4 造模与分组 参考卢敏等［5-6］的造模方法，孕前各组大鼠测量基础血压作为参考，每晚6∶00将雌鼠与雄鼠合笼，次日晨8∶00进行阴道涂片，连续5 d为1个周期，以观察到精子为大鼠怀孕第1天。孕10 d（给药前）重复测量收缩压进行对比，待孕12 d起造模组给予皮下注射L-NAME 125 mg/（kg·d），给药后第3天测量血压，若较给药前血压升高30 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）或以上则为造模成功。实验中共90只雌鼠参与建模，其中不明原因不孕13只，造模成功77只。造孕鼠干预过程中早产3只，灌胃死亡2只，最终剩余72只。采用随机数字表法分为6组，每组12只。

1.5 给药方法 大鼠给药剂量按人与动物每公斤体质量用药剂量折算系数计算：按60 kg成人剂量的折算系数W：6.25。正常妊娠组：12～19 d生理盐水0.5 mL/d皮下注射。子痫前期组：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射。阿司匹林组：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射+16～19 d阿司匹林10 mg/（kg·d）灌胃。补肾活血方低剂量组：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射+16～20 d补肾活血方低剂量0.3 mL［312.5 mg/（kg·d）］灌胃。补肾活血方中剂量组：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射，16～20 d补肾活血方中剂量0.3 mL［625 mg/（kg·d）］灌胃。补肾活血方高剂量组：13～19 d L-NAME 125 mg/（kg·d）皮下注射，16～20 d补肾活血方高剂量0.3 mL［1 250 mg/（kg·d）］灌胃。

1.6 标本采集与检测 1）大鼠血压的测量：分别于孕前、妊娠第10、15、20天测量大鼠收缩压。将大鼠固定于恒温箱中适应2～3 min，待大鼠充分安静后将尾根部置于尾套中，根部正中接触传感器。观察电脑中的波形为规则锯齿状波形后点击开始按钮，气囊开始充气至鼠尾血流完全被阻断后自动放气，待电脑波形重新出现规则锯齿波时即测得大鼠收缩压与舒张压。记录数值，连续加压测量3次，每次间隔1～2 min，取其平均值记录。2）尿蛋白：收集妊娠第10、15、20天24 h尿液进行尿蛋白定量分析。3）血小板、凝血四项：孕21 d腹主动脉取4～5 mL动脉血检测血小板计数（PLT）、凝血四项［凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT），升高纤维蛋白原（Fbg）］。4）TFPI-2水平：暴露大鼠子宫，将胎仔、胎盘从子宫中剖出，分离胎盘、胎仔，分别置于分析天平上称重，精确至0.001 g，部分胎盘固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后脱水，石蜡包埋，用于免疫组化监测TFPI-2。TFPI-2阳性反应表现为合体滋养细胞内有棕黄色颗粒沉着，根据German Immuno Reactive Score评分系统，将各组切片随机抽取5个视野，在400倍显微镜下观察，根据阳性表达强弱分级：0分为细胞内无染色、呈均匀淡黄色或与背景颜色一致；1分为少量淡黄色颗粒沉着；2分为较多淡黄色或棕黄色颗粒沉着；3分为细胞内有大量棕黄色或褐色颗粒沉着。根据染色面积分级：0分为阳性细胞染色面积为0；1分为阳性染色面积＜25%；2分为染色面积＜50%；3分为细胞内阳性染色面积＞50%。根据染色强弱分级和染色面积分级综合评分：（-）为0～1分；（+）为2～3分；（++）为4～5分；（+++）为5～6分。计算平均值作为QI值（QI值=强弱分级×面积分级）

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示；两样本组间表较采用t检验；不同时间点比较采用重复测量方差分析，多组间样本方差齐性时采用F检验和LSD检验，不齐选用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。统计绘图采用GraphPad Prism 5.0及Excel 2013软件处理。

2 结果

2.1 各组孕鼠给药前后收缩压与24 h尿蛋白比较 见表1，表2。孕前及孕10 d各组大鼠收缩压及24 h尿蛋白对比差异无统计学意义（P＞0.05）；孕15 d各组大鼠收缩压及24 h尿蛋白与正常妊娠组相比呈明显上升趋势，差异具有统计学意义（P＜0.05）；孕20 d与子痫前期组对比，各组大鼠收缩压及24 h尿蛋白呈不同程度下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组孕鼠给药前后收缩压比较（mmHg，±s）

表1 各组孕鼠给药前后收缩压比较（mmHg，±s）

注：与正常妊娠组比较，*P＜0.05；与子痫前期组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与补肾活血方中剂量组比较，▲P＜0.05。下同。

组别正常妊娠组子痫前期组阿司匹林组补肾活血方低剂量组补肾活血方中剂量组补肾活血方高剂量组n 12 12 12 12 12 12孕前112.41±6.58 106.50±7.93 106.83±11.00 105.50±8.29 111.00±9.53 103.75±6.66孕10 d 113.41±6.99 112.75±7.86 109.16±7.77 107.41±8.32 113.66±12.56 109.91±10.12孕15 d 113.08±5.90 155.83±6.67*154.41±8.97*154.66±8.11*160.33±8.45*160.08±9.09*孕20 d 109.00±5.37 162.16±5.37*135.08±9.22△△▲145.91±7.26△△▲123.33±8.74△△132.41±7.82△△▲

表2 各组孕鼠给药前后24 h尿蛋白比较（mg/24 h，±s）

表2 各组孕鼠给药前后24 h尿蛋白比较（mg/24 h，±s）

组别正常妊娠组子痫前期组阿司匹林组补肾活血方低剂量组补肾活血方中剂量组补肾活血方高剂量组n 12 12 12 12 12 12孕10 d 6.41±0.78 5.95±0.91 6.12±0.90 6.70±0.87 5.84±0.93 6.39±1.24孕15 d 6.20±0.51 12.36±1.66*12.77±1.78*13.21±1.60*12.76±1.06*13.05±0.91*孕20 d 6.33±0.98 14.30±2.20*9.41±1.40△△▲11.53±1.81△△▲7.28±1.06△△9.78±1.47△△▲

2.2 各组孕鼠PLT、凝血四项比较 见表3。与正常妊娠组相比，子痫前期组PLT、Fbg升高，PT、APTT、TT缩短，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；与子痫前期组相比，阿司匹林组和补肾活血方低、中、高剂量组PLT、Fbg下降，PT、APTT、TT明显延长，差异具有统计学意义（P＜0.05），中剂量组干预后血小板及凝血功能显著好转，差异明显具有统计学意义（P＜0.01）。

表3 各组孕鼠PLT、凝血四项比较（±s）

表3 各组孕鼠PLT、凝血四项比较（±s）

组别正常妊娠组子痫前期组阿司匹林组补肾活血方低剂量组补肾活血方中剂量组补肾活血方高剂量组n 12 12 12 12 12 12 PLT（×109/L）1 068.66±113.89 1 445.00±103.30*1 223.75±177.91△1 349.66±83.42△1 110.75±99.22△△1 255.08±119.03△PT（s）11.69±1.03 7.78±0.88*10.85±0.75△9.32±0.62△11.72±1.12△△10.66±1.43△TT（s）32.85±2.02 29.47±1.53*31.40±1.04△30.15±1.65△31.70±2.32△△31.14±1.60△APTT（s）18.06±0.70 14.73±1.26*17.98±1.48△15.54±1.96△18.54±0.97△△16.88±2.65△Fbg（g/L）1.57±0.20 3.20±0.33*2.30±0.45△3.09±0.40△1.63±0.33△△2.37±0.38△

2.3 各组孕鼠胎盘TFPI-2表达综合评分比较 见表4，图3。与正常妊娠组相比，子痫前期组大鼠胎盘中TFPI-2表达明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与子痫前期组相比，各干预组胎盘中TFPI-2表达呈不同程度变化，其中，补肾活血方低剂量组表达略有差异，差异具有统计学意义（P＜0.05），补肾活血方中剂量组胎盘中TFPI-2表达明显下降，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与阿司匹林组相比，补肾活血方低、高剂量组胎盘中TFPI-2表达变化不明显，差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组孕鼠胎盘中TFPI-2表达（苏木素染色，400倍）

表4 各组孕鼠胎盘TFPI-2表达综合评分比较（分，±s）

表4 各组孕鼠胎盘TFPI-2表达综合评分比较（分，±s）

组别正常妊娠组子痫前期组阿司匹林组补肾活血方低剂量组补肾活血方中剂量组补肾活血方高剂量组n 12 12 12 12 12 12 TFPI-2 7.18±0.64 14.54±1.04*12.74±0.93△12.15±0.75△10.87±0.64△12.38±1.06△

3 讨 论

子痫前期是一种严重的妊娠期特有疾病，是引起孕妇和围生儿死亡的主要原因之一。正常妊娠时存在着生理性的高凝状态，纤溶系统的活性也相应增强，使正常孕妇机体凝血与纤溶系统保持动态平衡状态。发生子痫前期时，血管内皮细胞受损，凝血因子及血小板功能明显增强，而抗凝血因子和纤溶酶原激活物活性降低，使机体凝血与抗凝平衡失调，呈明显的高凝状态血栓倾向［7］。

有研究表明，子宫螺旋动脉重塑是妊娠期间子宫与胎儿营养物质交换的关键环节，正常妊娠螺旋动脉的重塑可达到96%，而重度子痫前期并发FGR时只有10%［8］。参与子宫螺旋动脉重塑的间质滋养细胞穿透蜕膜、子宫内膜及子宫肌层1/3，在螺旋动脉周围聚集；然后，血管内滋养细胞以逆行方式沿螺旋动脉内腔迁移，取代内皮血管，使狭窄肌性管腔转变为扩张的低阻力子宫胎盘血管［9］。妊娠早期迁移的血管内滋养细胞在子宫螺旋动脉末端形成栓子，堵塞子宫动脉，使得子宫螺旋动脉重塑障碍。子痫前期患者胎盘组织内微血栓形成，与中医“血瘀”范畴相符合。

补肾活血方以寿胎丸为基础，方中菟丝子补肾填精，肾精充盛则胎元稳固。研究发现菟丝子黄酮［10］能增加成年大鼠腺垂体、卵巢及子宫质量，提高卵巢人绒毛促性腺激素/黄体生成素受体功能，改善垂体对促性腺激素释放激素的反应性，促进hCG分泌。续断、桑寄生补肝肾，能破瘀血，生新血，令胎牢固，研究表明，桑寄生中的黄酮类物质可以改善生殖轴功能，促进激素分泌，补肾活血、增加妊娠率［11］；阿胶滋阴养血，冲任气血旺盛，胎元稳固。全方以补肾安胎为根本，结合子痫前期患者可能与子宫螺旋动脉重铸障碍、胎盘微血栓相关，加用丹参，祛瘀生新而不伤正，既活血又养血，能提高组织耐缺氧能力，改善胎盘微循环，达到抗血栓作用［12］。全方在寿胎丸基础上化裁，增加了化瘀作用，治以补肾化瘀安胎之法，以期能改善子痫前期患者胎盘缺血缺氧，延长孕周，降低母胎死亡风险。

TFPI-2是一种分子量为29 kD的丝氨酸蛋白抑制家族成员［13］。周琼洁［14］通过对孕妇血清和胎盘TFPI-2表达的观察，发现子痫前期孕妇血清中TFPI-2含量与胎盘中TFPI-2表达呈相反作用，这可能与子痫前期孕妇胎盘中TFPI-2表达不稳定有关，受多因素影响。王晓丹等［15］通过实验发现：胎盘滋养细胞TFPI-2有明确表达，并且子痫前期患者胎盘中TFPI-2的表达明显低于妊娠期高血压患者和正常妊娠者。Katalin Karaszi［16］报道，在早期子痫前期合并或不合并HELLP综合征的胎盘组织中TFPI-2表达较高。

补肾活血方能不同程度改善子痫前期大鼠血液高凝状态，降低PLT，缩短PT、TT及APTT，降低血栓风险；同时可以减少TFPI-2在胎盘中的表达，提示补肾活血方对子痫前期大鼠模型血栓前状态具有治疗作用。根据不同剂量补肾活血方对比，低剂量作用效果一般，中剂量效果良好，高剂量作用效果与阿司匹林类似，提示不同剂量补肾活血方对改善子痫前期大鼠血液高凝状态具有治疗作用，但其安全性和有效性还需进一步研究。