T淋巴细胞在新生隐球菌感染中的防御作用

李肃静 皇幼明 唐慧 崔虹 滕艳 陶小华 樊一斌，

(1.蚌埠医学院临床医学系研究生院，蚌埠 233000；2.浙江省人民医院 杭州医学院附属人民医院皮肤科，杭州 310014)

新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)是一种具有多糖荚膜的机会致病性酵母菌。全球每年超过100万人感染，致死人数过65万[1]。干燥的酵母细胞通过呼吸进入肺部产生感染，免疫功能正常的宿主具有自限性，而免疫功能低下者(如艾滋病、免疫力低下的孕妇、X连锁免疫缺陷、肝病、特发性CD4+T细胞缺乏等)则会增加感染新生隐球菌的风险[2]。T细胞来源于骨髓并在胸腺中发育成熟[3]，可以在免疫应答中起调节因子和效应因子的作用，不同的T细胞亚群参与了对新生隐球菌感染的免疫应答。

固有免疫是宿主抵御新生隐球菌入侵机体的第一道防线，单核细胞被趋化到肺部并分化为巨噬细胞和树突状细胞[4]。新生隐球菌为逃逸巨噬细胞的吞噬机制，通过特洛伊木马策略、细胞吞噬和细胞旁穿越在宿主中扩散[5]。树突状细胞除吞噬和破坏入侵的隐球菌，还可以上调趋化因子受体及共刺激分子并提呈给初始T细胞，根据在树突状细胞上表达的共刺激分子的类型，其可以诱导不同的辅助T细胞。共分为三类：①辅助性T细胞1(Th1)，产生促炎反应，杀死细胞内病原体。②辅助性T细胞2(Th2)与促进抗体分泌、嗜酸性粒细胞增多以及抗炎免疫反应相关。③辅助性T细胞17(Th17)细胞与自身免疫性疾病相关[6]。除了辅助性T细胞以外，CD8+T细胞、NKT细胞、γδT细胞也在宿主的免疫应答中发挥着重要作用。

1 CD4+T细胞(CD4+ T cell)

CD4+T细胞是宿主介导细胞免疫的重要组成部分，根据所产生的细胞因子和效应细胞的特征可以将其分为Th1、Th2和Th17亚群[7]。三种类型的细胞免疫应答之间的平衡会对感染产生影响。有研究表明在小鼠中，CD4+T细胞促进宿主的抗新生隐球菌作用以及相关细胞因子和趋化因子的转录表达。CD4+T细胞缺失的小鼠存活时间明显缩短[8]。有研究表明隐球菌甘露糖蛋白(MP)的糖基化明显提高其抗原性以及刺激保护性CD4+T细胞反应的发生。CD4+T细胞缺乏是人类隐球菌感染的主要诱发因素，CD4+T细胞计数小于100个细胞/μL和可检测到的血清隐球菌多糖荚膜抗原(CrAg)预示着HIV相关隐球菌病患病风险的增加。隐球菌也可在没有HIV感染的情况下，出现在特发性CD4+T细胞减少症中。然而近年来同时有实验表明，尽管CD4+T细胞可以控制真菌生长，但也可能会提高中枢神经系统感染新生隐球菌期间的免疫病理反应和死亡率[9]。

1.1 辅助性T细胞1(T helper cells 1，Th1)

免疫正常的宿主对吸入的新生隐球菌主要产生Th1型反应，既可以直接接触并杀伤新生隐球菌，介导被感染部位肉芽肿的形成，阻止新生隐球菌的进一步扩散[10]。也可以在树突状细胞和巨噬细胞受到隐球菌刺激产生IL-12后，细胞因子诱导CD4+T细胞向Th1轴的方向分化。Th1轴主要通过细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α对新生隐球菌进行有效的细胞免疫。每种细胞因子的作用机制又各不相同。IL-2 是一种具有双向免疫调节作用的生长因子，通过激活、增殖、分化T细胞和NK细胞，直接抑制新生隐球菌的生长[11]。除此之外，IL-2还可以诱导血清中IFN-γ的升高，并进一步激活小胶质细胞，防止新生隐球菌感染的播散[12]。IL-12主要由活化的抗原提呈细胞分泌产生，并在TNF-α的作用下调节原始Th细胞向Th1细胞的分化和生成。有研究发现，IL-12缺陷型小鼠致使免疫反应从保护性Th1型向非保护性Th2型转换[13]。IFN-γ作为驱动细胞免疫的关键细胞因子具有介导M1型巨噬细胞有效杀伤病原菌的作用。IFN-γ通过STAT1信号将未成熟的巨噬细胞活化为M1型巨噬细胞，并表达大量的一氧化氮合成酶(iNOS)，介导L-精氨酸产生一氧化氮后消灭新生隐球菌[14]。同时有研究表明，STAT1缺失阻抑Th1的分化而使Th2的分化占优势[15]。TNF-α是一种在新生隐球菌感染早期由单核巨噬细胞释放的单核因子，具有促进淋巴样细胞增殖分化及减少M2型巨噬细胞激活的生物活性[16-17]。有研究表明，艾滋病患者在感染受到隐球菌感染后，通过调控NF-kB的激活和潜在的TNF-α mRNA转录和调控来抑制TNF-α的表达[18]。对于接受抗TNF-α治疗的脓毒症、癌症和自身免疫性疾病的患者，新生隐球菌感染的风险明显增加[19-21]。在体外试验中，IL-2、IL-12、IFN-γ的减少会增加肺部及脑部真菌的感染风险[22-23]。对于艾滋病合并新生隐球菌脑膜脑炎患者，IL-2、IL-12、IFN-γ可以降低患者脑脊液真菌的负荷量提高，改善患者的预后[24]。

1.2 辅助性T细胞2(T helper cells 2，Th2)

Th2细胞及其表达的IL-4、IL-5和IL-13通过产生的抗体介导体液免疫应答。Th2细胞因子也是巨噬细胞的活化介质，通过介导M2巨噬细胞活化并表达精氨酸酶-1，进而消耗L-精氨酸，不能产生NO，机体抵抗真菌的能力下降[25]。IL-4是一种抗炎因子，通过调控T细胞分化诱导Th2型免疫反应和诱导M2型巨噬细胞活化对宿主的保护过程起到负调节作用。在动物模型中发现IL-4水平的增加与新生隐球菌细胞清除减慢和感染小鼠死亡增加有关，同样，在人类的艾滋病和隐球菌脑膜脑炎患者中，高血清IL-4水平与HIV和免疫重建炎性反应综合征(IRIS)的发生及死亡相关[6]。IL-5是一种与细胞因子特异性亚基受体IL-5Rα结合，促进IgE产生和嗜酸性粒细胞增加的非特异性细胞因子[26]。在动物模型中，IL-5促进嗜酸性粒细胞在肺部隐球菌感染部位的聚集和活化[27]。IL-13通过抑制Th1型细胞反应和启动巨噬细胞替代途径的激活，促进新生隐球菌的持续感染[28]。

新生隐球菌的毒力因子会破坏宿主的免疫系统，引发疾病，其作用机制也与Th2型免疫反应密切相关。几丁质通过壳三糖苷酶诱导CD11b+树突状细胞应对肺部新生隐球菌的感染，刺激IL-4和IL-13的产生并介导M2巨噬细胞活化[29-30]。葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖作为荚膜的主要成分锚定于新生隐球菌的细胞壁上，通过CD14和Toll受体4(TLR-4)刺激细胞，导致产生TNF-α的通路被抑制[31]。脲酶作为新生隐球菌的主要毒力因子，可以促进未成熟树突状细胞的积聚并引发非保护性的Th2型免疫应答[32]，漆酶通过诱导Th2型反应促进新生隐球菌向宿主中枢神经系统传播[33]，黑色素则诱导IL-4的产生，产后患者Th2型反应的增强引起隐球菌感染，表现为无肉芽肿形成的肺炎[34-35]。

1.3 辅助性T细胞17(T helper cell17,Th17)

IL-17、IL-22、IL-23和TGF-β是Th17细胞分泌的主要细胞因子。转化生长因子(TGF-β)和 IL-6共同诱导初始(naive)T细胞分化为Th17表型[36]。IL-17通路通过上调促炎性细胞因子、抗菌肽及中性粒细胞趋化因子来启动和调节真菌免疫[37-38]。IL-17A在先天性免疫阶段产生，新生隐球菌感染早期IL-17A并不能发挥作用，反而导致Th1免疫应答降低，并减弱宿主对新生隐球菌感染的防御作用[39-40]。感染后期则通过白细胞募集，活化和产生γ干扰素调节宿主对隐球菌的遏制和清除[41]。在动物模型中，IL-17针对隐球菌感染起到了保护性免疫作用[42]。在人类研究中，IL-17的提高可以增强真菌清除率和改善临床疗效[43]。JAK2/STAT3信号通路和半乳糖木糖甘露聚糖(GalXM)在Th17细胞的分化中起着关键作用，活化的CD4+T细胞产生IL-6，刺激JAK2/STAT3通路，从而诱导谱系特异性主调控因子RORgt的表达，促进Th17细胞的分化[38]。半乳糖木糖甘露聚糖(GalXM)是小鼠树突状细胞的有效激活剂，当与T细胞共培养时，可诱导Th17细胞因子反应[36]。现阶段研究表明MAPK信号通路与巨噬细胞抗新生隐球菌的免疫过程存在显著关联。IL-17通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路介导巨噬细胞趋化因子(c-c基序)配体7(CCL7)表达上调，CCL7水平的增加诱导隐球菌感染初期 INF-γ 的产生。IL-23为IL-17 重要上游分子，可促进Th17细胞活化、增殖和炎性细胞因子的分泌。IL-23通过IL-17非依赖性抑制嗜酸性粒细胞募集和IL-17依赖性调节抗体产生和嗜酸性晶体(YM1和YM2)沉积来抑制对隐球菌感染的过敏反应[44]。在动物模型中，IL-23细胞因子对隐球菌感染发挥保护作用，IL-23的缺失会导致炎症细胞的趋化和细胞因子反应减弱，为新生隐球菌感染免疫提供了潜在的治疗靶点。

1.4 调节性T细胞(Treg cells)

Treg是CD4+T细胞的一个特殊子集，可以抑制自身免疫反应，其发育依赖于转录因子FoxP3的表达[45]。Treg细胞和Th17来源于相同的前体T淋巴细胞，在特定细胞因子调控下向不同方向分化。Treg细胞通过产生IL-10抑制肺Th2细胞反应[46]。Treg在真菌的感染过程中既可以发挥有益也可以发挥有害作用。Treg细胞可以打破Th1/Th2/Th17的动态平衡，降低Th2细胞因子的表达，抑制Th17的分化。在Treg缺失的小鼠中，IgE、嗜酸性粒细胞和Th2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)的产生增加，小鼠体内的真菌负荷量显著增加[47]。Treg通过共定位C-C趋化因子受体5型(CCR5)和IFN调节因子4(IRF4)与肺实质中的Th2效应细胞，抑制Th2型免疫反应[48]。此外, Treg细胞的生长因子IL-2抑制Th17细胞的分化[49]。

2 CD8+T细胞(CD8+T cells)

CD8+T细胞在新生隐球菌宿主的免疫应答中同样发挥着重要的作用，CD8+T细胞通过直接接触杀伤、产生TNF-γ限制新生隐球菌细胞。在体外，CD8+T细胞可以直接抑制隐球菌的生长繁殖，利用颗粒素直接杀伤新生隐球菌[50]。CD8+T细胞的增殖、趋化及产生IFNγ细胞因子的作用不依赖于CD4+T细胞，CD8+T细胞产生的IFN-γ限制了新生隐球菌在巨噬细胞中的生长和存活[51]。同时，CD4+T细胞的缺失会导致CD8+T细胞的增殖。CD8+T细胞在隐球菌感染期间可以产生IFN-γ和TNF-α等Th1型细胞因子，而Th2型细胞因子则只能由CD4+T细胞分泌[52]。

3 自然杀伤T细胞(NKT cells)

自然杀伤T细胞是一类来源于胸腺的天然T淋巴细胞，在其抗感染的免疫过程中，活化的NKT细胞能够产生IFN-γ和IL-4活化自然杀伤细胞和巨噬细胞[53]。NKT细胞在诱导保护性Th1免疫应答过程中发挥重要作用。新生隐球菌感染后，Vα14 NKT细胞在肺部聚集，具有单核细胞趋化因子-1(MCP-1)趋化因子依赖性[54]，DCs可以激活NKT细胞。NKT细胞递呈隐球菌脂质抗原，诱导延迟型超敏反应，并在Th1型免疫反应中发挥重要作用[54-56]。此外，用α-半乳糖神经酰胺激活的Vα14 NKT细胞会进一步导致Th1免疫应答[56]。NKT细胞也分泌IL-4，这表明该亚群同时调节Th1和Th2介导的免疫应答[57]。

4 γδT细胞(γδT cells)

依据T细胞表面抗原受体(T cell receptor,TCR)不同，可将T细胞分为αβT细胞和γδT细胞。γδT细胞可能通过作为黏膜水平的第一道防线，在抗真菌宿主防御中发挥重要作用[58]。γδT细胞在外周血中百分比很低，早前被认为是一种没有记忆能力的原始T细胞，却在白细胞趋化和诱导免疫应答中发挥重要作用[54,59]。γδT细胞主要产生 IL-17(γδT17)和 IFN-γ(γδT1)，γδT细胞产生 IL-17不需要抗原的诱导，然而产生 IFN-γ需要抗原的诱导。与NKT细胞不同，新生隐球菌感染早期γδT细胞在肺部积累的过程中不依赖MCP-1趋化因子。IL-17A主要由中性粒细胞产生[60]，然而，中性粒细胞对γδT细胞产生IL-17A进行负调控，在中性粒细胞缺失时，γδT细胞可以产生与保护性免疫反应相关的IL-17A细胞因子[61]。

5 小 结

T细胞在宿主对新生隐球菌的防御中起着关键作用。Th1、Th2和Th17在宿主中通常处于平衡状态，三种类型细胞因子与新生隐球菌病的发生、发展和预后密切相关。此外，Treg细胞在协调T细胞各亚群之间的平衡中很重要。虽然CD8+T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞对真菌的防御过程的作用尚未完全了解，但一些研究表明，它们也有助于宿主对真菌的防御。

目前在新生隐球菌病治疗领域中还没有公认有效的免疫治疗方案，但有研究表明细胞因子可用于靶向治疗新生隐球菌病的新方向，包括免疫治疗靶细胞和抗真菌的疫苗开发，隐球菌甘露糖蛋白MP诱导了Th1型反应，为基于MP制备新生隐球菌疫苗提供了可能[62]。IL-12治疗感染隐球菌的小鼠，防止了全身隐球菌病和隐球菌脑膜脑炎的发生[63]。这些可能在未来成为常规抗真菌治疗外的重要辅助治疗方案[64]。