基于网络药理学和高分辨质谱分析半夏厚朴汤潜在药效成分

生立嵩，苏酩，谢亚欣，2，张新军，彭丽，许祚芝，刘善新*

(1.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；2.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；3.华润双鹤利民药业(济南)有限公司 质量部，山东 济南 250200)

半夏厚朴汤始载于汉张仲景《金匮要略》“妇人咽中如有炙脔，半夏厚朴汤主之”，处方为半夏一升、厚朴三两、茯苓四两、生姜五两、苏叶二两,有行气散结、化痰降逆的功效，近代以来主要治疗梅核气[1]。现代该方应用广泛，临床研究用于治疗抑郁症[2]、反流性食管炎[3]、睡眠呼吸暂停综合征[4]、咳嗽[5]等。前期本课题组结合临床应用，筛选半夏厚朴汤抗PDE4(磷酸二酯酶4)活性成分，并以液相色谱-质谱联用分析提取其中成分[6]，但对应化合物数量较少，种类单一，这提示所选靶点及潜在药效成分存在一定问题。鉴于此，我们以计算机虚拟筛选与高分辨质谱检测相结合的方法，应用网络药理学搜集半夏厚朴汤药材的成分及其作用靶点；采用TCMIO(中药免疫肿瘤学数据库)等中药成分数据库和软件进行预测和分析，预测半夏厚朴汤主要作用靶点；为研究组方中小分子与蛋白的相互作用机制，对半夏厚朴汤中已报道化合物[7]进行分子对接拟合和亲和能打分，筛选亲和能值较低的化合物。以高分辨质谱法分析半夏厚朴汤提取物的成分及含量，筛选提取物中含量较高且在虚拟筛选中亲和能值较低的作为半夏厚朴汤的潜在药效成分组。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

DNA503型千分之一电子天平(南京伯尼塔科学仪器有限公司)；KDM型控温电热套(鄄城华鲁电热仪器有限公司)；KQ-250DA型数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Q-Exactive型超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱质谱仪(美国赛默飞公司)。

1.2 试药

茯苓(批号201001)、厚朴(批号200502)、半夏(批号191201)、生姜(批号200702)、苏叶(批号200501)均购自山东建联盛嘉中药有限公司，由济南亿民药业有限公司冉蓉高级工程师鉴定，均为2020年版《中国药典》一部收载的正品。

1.3 研究工具

数据库：中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://tcmsp-e.com/)、中药免疫肿瘤学数据库(TCMIO，http://tcmio.xielab.net/)、药物化学数据库(ChemBL, https://www.ebi.ac.uk/)、RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)、STRING(https://www.string-db.org/)；数据及化合物处理软件：Discovery Studio 2016单机版、AutoDockTools 1.5.6、AutodockVina 1.1.2、Cytoscape 3.6.1；质谱分析软件：Compound Discoverer 3.0、Xcalibur 3.0.63。

2 方法与结果

2.1 成分数据库搜索和建立

从TCMSP、TCMIO等数据库中搜集半夏厚朴汤五味药材的报道成分，下载所有成分mol2格式文件，采用Autodock自带的raccoon软件处理结构，生成pdbqt格式文件，作为对接成分分子数据库。共得到五味药材所报道化合物402个，主要包括黄酮类、三萜酸类、甾醇类、有机酸类等。

2.2 网络药理学研究和靶点收集

本研究采用两种方法[8-9]搜集半夏厚朴汤的潜在靶点：(1)从药效成分入手，选择TCMSP数据库中半夏厚朴汤五味药材已报道化合物，选择其中成药性良好(OB≥30%且DL≥0.18)的化合物对应靶点，将这些靶点与Genecards网站中，与咳嗽(关键词cough)和神志疾病(关键词mental disease)相关靶点进行Venn交集，重叠靶标在STRING数据库中构建PPI(protein-protein interaction)网络，经Cytoscape进行拓扑分析后，选择拓扑值较高的作为半夏厚朴汤候选靶点；(2)从所有报道成分入手，选择TCMSP数据库中每味药材所有报道化合物的靶点，将每个化合物所对应的靶点进行加和统计，选择相关度最高的作为半夏厚朴汤潜在靶点。

在TCMSP数据库中，共收集到成药性良好分子44个，这44个分子对应的靶点共有121个，采用Venn 图分析半夏厚朴汤可能作用的靶点数量，结果如图1所示，药效成分的预测靶标和咳病(cough)、神志疾病(mental disease)二者的共有靶标21个。运用STRING 网络平台进行重叠靶标的PPI网络构建，同时使用Cytoscape的network analyse功能对PPI网络进行分析，结果见表1，度值(degree)排名前2的靶标分别是IL6和VEGFA。基于总体成分预测的靶点加和后结果如表2所示，排名最靠前的是GABR和PTGS两个靶标。综合上述网络药理学研究，以这4个靶点作为半夏厚朴汤作用的潜在靶点。

图1 Venn网络图

表1 基于药效成分的预测靶标

表2 半夏厚朴汤成分相关靶蛋白及关联度

2.3 分子对接

对2.2节中筛选的潜在靶点，参考Autodock软件[7]的说明进行分子处理和对接操作：从RCSB(protein data bank description)网站中搜集相关靶点蛋白的结构，以蛋白自带的配体结构和位点作为结合域，以Autodock软件对蛋白质进行去水、加氢、加电荷操作。以Autodock vina 4.1软件，利用蛋白质晶体中自带的抑制剂位置作为结合位置，设置结合位点和结合范围大小，Docking算法采用local search以提高计算速度。利用2.1节搜集的药材报道化合物分子进行分子对接，将所有结果的亲和能值(affinity，kJ/mol)进行排序，选择亲和能值较低的前10%作为潜在有效化合物。

分子对接主要参数如表3所示，每个靶点结合能最低的前10个化合物结果如表4所示，4个靶点中对接较好的化合物为黄酮类和黄酮苷类，其次为三萜酸类和有机酸酯类。其中有3个黄酮类化合物在3个靶点中对接表现较好，这可能是PAINS[10]类化合物，也可能是药物潜在有效分子。其中打分最优化合物与靶点对接的二维图如图2所示。

表3 分子对接参数

表4 半夏厚朴汤与候选靶点分子对接结果

注：灰色线代表小分子结构图；粉色、紫色、深粉色虚线代表疏水作用力；深绿色虚线代表氢键作用力；浅绿色虚线代表范德华力；深红色代表unfavorable donor-donor 作用。

2.4 饮片提取和样品制备

表5 样品提取方法

2.5 高分辨质谱及CD分析

色谱柱Thermo Scientific Hypersil(100 mm×2.1mm)；流动相为0.5%甲酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～27 min，流动相A 10%～90%)，条件如下所示：流速0.3 mL/min；质谱条件扫描范围80～1 200m/z；源内诱导碰撞解离电压(CID)0.0 eV；分辨率70 000；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；正/负离子检测，进样量5 μL。

参考文献[11]方法使用Compound Discoverer软件分析质谱数据，采用chemspider、m/zcloud等质谱数据库匹配化合物。使用Xcalibur软件对检测数据进行处理。选择m/zcloud best match 打分≥70.0分的化合物，认为有较高的匹配度。

将高分辨质谱数据经Compound Discover 3.0软件分析后共收集高匹配度化合物176个，经比对，发现有19个化合物在半夏厚朴汤报道成分数据库中，这些成分在既往研究中已证实存在于半夏厚朴汤成分药材中，又能在提取物中被检测到，因此可认为是半夏厚朴汤的潜在有效成分组，具体结果见表6，其中有3个在分子对接中表现较好(分子对接打分前10%)：野黄芩苷，芹菜素，熊果酸。含上述化合物的高分辨质谱图结果如图3所示。

表6 半夏厚朴汤潜在有效成分组的亲和能

注：①—野黄芩苷；②—芹菜素；③—熊果酸。

以19个对应化合物的亲和能和离子峰面积赋权作为指标，一般认为，亲和能和结合能力呈对数关系，所以赋权公式按下式计算：

式中，S为以潜在有效成分指标的分子对接亲合能赋权值，i为化合物编号，A为离子峰面积，Af为亲和能。计算结果见表7。

表7 潜在有效成分的亲和能赋权值

3 讨论和结论

本文采用整合药理学方法，结合半夏厚朴汤传统和现代临床应用分析其潜在靶点，这些靶点涉及神经系统、免疫系统，采用虚拟筛选和分子对接技术，筛选半夏厚朴汤潜在有效成分，在筛选中表现良好的化合物主要包括黄酮类、三萜酸类等，其中熊果酸[12-13]、芹菜素[14]、野黄芩苷[15]等均有文献报道参与IL6、PTGS等靶点和信号通路的作用。采用高分辨质谱方法和化合物匹配软件，分析了不同提取方法下半夏厚朴汤的成分，其中有121个匹配打分超过70.0分，有19个与半夏厚朴汤药材报道成分吻合，有3个虚拟筛选打分靠前(前10%)。结合中药传统应用方式，认为这些化合物可能共同形成半夏厚朴汤潜在药效成分组。

在本研究中，采用多种方法开展网络药理学靶点富集。最终搜集的4个靶点中，有3个为常见的炎症、免疫相关信号通路，而GABR则为中医神志病常见靶点，这与半夏厚朴汤用于抑郁症的临床应用契合较好。说明本研究中网络药理学分析方法可靠，结果可信，在一定程度上弥补了近年来肿瘤免疫学研究的不足，为后续的小分子虚拟筛选提供了较为可靠的靶点结论。

中药成分复杂，药理作用广泛，在特定疾病的治疗中具备独特优势。中药成分发挥药理作用，往往需要达到特定的剂量，本文研究过程中，对所涉及潜在有效化合物定量研究未能开展，发挥药效的剂量因素，还要进一步查阅文献。本文以不同溶剂提取半夏厚朴汤，采用高分辨质谱分析，可比较其中特定成分的大小差异，为后续的提取工艺研究奠定基础。

目前的中药系统药理学和网络药理学研究中，对中药的生物信息学研究较多，而对发挥药理作用的物质基础部分，即成分的研究重视程度还不够，在筛选得到潜在有效靶点和相关化合物后的分子对接、靶点的结合域选择、亲和能等主要指标相对比较笼统，也往往不对靶蛋白自带的抑制剂小分子进行对照研究以保证分子对接的可靠性。在本研究中，为克服对接分子数量少带来的数据偏差，引入虚拟筛选功能，对文献报道的全部四百多个化合物均进行对接运算，这样既能兼顾靶点的全面性，又能有效地衡量化合物针对特定靶点的有效性。相较而言，采用本研究方法更能筛选得到有较高活性的潜在有效化合物。

本研究确定了半夏厚朴汤发挥药效的潜在活性成分(组)，但这些成分是否能有效代表半夏厚朴汤的绝大多数药理活性还不得而知。后续的药理实验和分子生物学分析有待开展，希望通过后续药效学验证，对本文中所发现的潜在活性成分组进行深入研究，验证成分组是否能真正代替半夏厚朴汤整体药效，以及这些成分的具体药理活性。