银杏内酯C标准样品的研制

宁凡盛，路岩翔，曹桂云，孟兆青，闫慧娇，王岱杰

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)a.山东省分析测试中心; b.药学院，山东 济南 250014；2.济南市行政审批服务局，山东 济南 250001；3.山东宏济堂制药集团股份有限公司，山东 济南 250000)

银杏叶由银杏科植物银杏GinkgobilobaL.的叶子干燥而成[1]，是目前中药常用品种，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂的功效[2-5]。现代药理研究表明，银杏叶提取物能够抗氧化、抗衰老、降血压、促进血液循环、提高脑部功能[6-8]。银杏内酯C是银杏叶中主要的活性成分，是控制药材质量和成药标准的重要指标[9-11]。银杏内酯是一类具有特殊分子结构的二萜内酯类化合物，银杏叶制剂的疗效和内在质量是由银杏内酯的含量决定的[12]。目前国内市场上的银杏内酯C以对照品为主，纯度在85%～98%，级别参差不齐，未按照国标的要求对其进行相关标准品评测，样品不具有溯源性[13-16]。为满足银杏、银杏叶及其他含有银杏内酯C药材的成分分析、样品检测、质量控制等需求，保证结果的可比性、准确性和溯源性[17]，急需对银杏内酯C进行标准样品的制备研究。

GB/T 15000.2—2019《标准样品工作导则第2部分：常用术语及定义》[18]中关于标准样品的定义是：足够均匀的一种或多种，具有化学的、物理的、生物学的、工程技术的或感官的等性能特征，经技术鉴定，附有说明相关性能数据证书的样品。标准样品可以对仪器进行校准，对相关测量方法进行评价和对材料赋值[19-22]。天然产物标准样品是天然产物质控方面确认产品质量不可或缺的参照物，具有高度均匀性和良好的稳定性。但我国目前已研发出的天然产物标准样品，无论在种类还是在数量上均严重不足，直接给相关产品的检验和检测带来困扰，同时还制约了相关检测和质控行业的发展[23]。本文为解决银杏内酯C标准品缺乏的问题，参照GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则(3)标准样品 定值的一般原则和统计方法》[24]，成功研制出满足国家标准的银杏内酯C样品，其结构见图1。

图1 银杏内酯C的化学结构式

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

DZKW-C恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；旋转蒸发仪R-3(瑞士Buchi公司)配有V-700真空泵(瑞士Buchi公司)；DLSB-5/20低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；DHG-9070A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Shimadzu LC-6AD高效液相色谱系统(日本Shimadzu公司)；Agilent 1220高效液相色谱仪(美国Agilent科技公司)；岛津TG-40 DTA-40M 热重分析仪(日本Shimadzu公司)；Elementar全自动元素分析仪vario EL III(德国Elementar公司)；SP-20E型全自动点样仪(上海科哲生化科技有限公司)；WRS-1B数字熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)；UV-2700紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；Agilent 6520 Q-TOF四极杆联用飞行时间质谱(美国Agilent科技公司)；INOVA 400 MHz核磁共振波谱仪(美国Varian公司)。

1.2 实验材料

无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，瑞典Oceanpak试剂公司)；实验用水为超纯水；柱层层析硅胶(100～200目)(青岛鼎康硅胶有限公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(Amersham Biosciences公司)；G254薄层硅胶板(青岛海洋化工厂)。

实验所用银杏叶均购自济南建联中药店，由山东中医药大学李佳教授鉴定为银杏科植物银杏GinkgobilobaL.的干燥叶。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 样品的提取

2.1.2 样品的纯化

制得的银杏内酯C经冷冻干燥得到白色粉末，用4 mL棕色瓶进行分装，每瓶10 mg(十万分之一天平称量)，分装好的样品瓶放在4 ℃冰箱中长期保存。

2.2 纯度分析方法

2.2.1 高效液相色谱分析

将制备得到的高纯度银杏内酯C溶于甲醇，配制质量浓度为1.5 mg/mL的溶液，使用配有蒸发光检测器的高效液相色谱仪(HPLC-ELSD)检测，柱温设置25 ℃，进样15 μL，流速为1.0 mL/min。ELSD检测条件：漂移管温度105 ℃，气体流速3.5 L/min，增益值为1。等度色谱条件：色谱柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相乙腈(A)-水(B)，0～30 min，32%A；运行时间30 min。梯度色谱条件：色谱柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相乙腈(A)-水(B)；梯度：0～30 min，10%～100%A，30～35 min，100%A。

等度色谱分析结果显示扣除溶剂峰后，样品纯度高于98%；梯度色谱分析结果显示30～35 min未有明显杂质峰出现，证明样品是单一的、纯度高于98%的银杏内酯C。色谱分析结果见图2。

图2 银杏内酯C HPLC图谱

2.2.2 薄层鉴别

点样结果表明，样品在两个展开体系中均呈现单一棕黄色斑点，Rf值分别为0.50(展开剂I)和0.31(展开剂II)，样品向上延展的路径中没有明显杂质斑点出现。薄层色谱图见图3。

图3 薄层色谱图

2.2.3 液质联用纯度分析

色谱柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；流动相乙腈(A)-水(B)；梯度洗脱条件0～30 min，10%～100%A；运行时间30 min。质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，扫描范围为m/z=100～1000，载气为高纯度氮气，气体流速为10 L/min，载气温度设置300 ℃，毛细管电压为4.0 kV。

液质联用(LC-MS)分析结果表明，正离子和负离子模式下的总离子流图均未见明显杂质峰存在。总离子流图见图4。

图4 银杏内酯C总离子流图

2.2.4 热重分析

精密称定银杏内酯C样品5.0 mg于热重分析(TG)用坩埚中，热重条件初始温度30.0 ℃，最终温度600.0 ℃，升温速率10 ℃/min，流量100 mL/min，气体为氮气。

分析结果表明，在温度28.1～298.5 ℃范围内，样品的热重曲线是一条直线(无明显变化)，说明银杏内酯C中基本不含有吸附水和易挥发性物质，热稳定性良好。当温度上升至353.4 ℃时，样品开始分解。TG曲线见图5。

图5 银杏内酯C的TG曲线

2.3 结构确认

银杏内酯C的结构确认采用4种常见光谱技术(紫外、红外、质谱和核磁共振技术)。紫外分析法(UV)以甲醇为测试溶剂，扫描范围为190～640 nm。红外分析法(IR)使用KBr压片液膜，扫描范围为400～6 000 cm-1，采样速率为80张/s。质谱分析法(MS)使用高分辨质谱，离子源为ESI离子源，载气为普通氮气，锥孔氮气流速10 L/min，载气温度350 ℃，毛细管电压4.0 kV，扫描范围m/z=100～1 500。核磁共振分析法(NMR)氘代溶剂为DMSO，采集1H谱和13C谱。

图6 银杏内酯C的UV谱图

图8 银杏内酯C质谱图

表1 银杏内酯C的核磁共振氢谱数据

以上各项光谱数据与文献[25]报道的银杏内酯C基本一致，化合物结构鉴定结果为银杏内酯C。

2.4 均匀性检验

按照工作导则中均匀性检验的要求，采用随机抽取、重复测量的方法，从分装好的样品中随机抽取10瓶，按照3种抽取方式(第一次抽样为1、3、5、7、9、2、4、6、8、10号瓶；第二次抽样为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1号瓶；第三次抽样为2、4、6、8、10、1、3、5、7、9号瓶)，然后从每瓶中精密称定1.5 mg样品3份，用色谱甲醇溶解定容至1 mL容量瓶备用，按照2.2.1项下等度色谱条件对每个样品进行测定，以样品峰面积的百分比读取样品纯度，数据进行均匀性检验和方差分析，计算出F值，以确定银杏内酯C的均匀性是否良好，检验结果见表2～3。

表2 均匀性检验数据

表3 方差分析数据

(1)

瓶间标准偏差计算：

(2)

u均=Sbb=0.008。

(3)

F值计算：

F=SM间/SM内=2.04。

(4)

以υ1(即组间)=9及υ2(即组内)=20，查询F界值表，得F0.05(9, 20)=2.94，由于F=2.04<2.94，说明银杏内酯C的均匀性良好。

2.5 稳定性检验

将银杏内酯C储存在0～4 ℃，考察样品2年的稳定性。分5个时间段考察，按2.2.1项下等度条件进行分析，使用峰面积百分比对样品纯度进行计算。每个样品复测5次，采用t检验法对实验结果进行统计分析，计算稳定性的不确定度[26]，分析结果见表4。

表4 稳定性检验试验结果

斜率计算：

(5)

截距计算：

(6)

直线模型的标准偏差：

(7)

将s=0.017代入公式，斜率相关的不确定度：

(8)

u稳=s(b1)×t=0.001×24=0.024。

(9)

查表得，自由度为(n-2)和95%置信水平(p=0.95)的t0.95,n-2=3.182，由于|b1|

上述计算结果说明，银杏内酯C样品在2年内的长期稳定性好。

2.6 定值分析

按照标准样品工作导则GB/T 15000.3—2008的要求，选取8个实验室进行定值实验，随机抽取24瓶样品，每个实验室分配3瓶，每瓶样品进行2次平行测定。采用高效液相色谱法测定样品纯度，利用各实验室的纯度数据计算平均值和标准偏差，进行定值实验。银杏内酯C纯度定值结果汇总如表5所示。

表5 协作定值数据汇总

测定结果总平均值的计算：

(10)

各实验室平均值的标准偏差：

(11)

总平均值标准偏差：

(12)

多家定值的不确定度：

(13)

标准样品的不确定度由以下3部分组成：(1)均匀性检验的不确定度(u均=0.008%)，(2)稳定性检验的不确定度(u稳=0.024%)，(3)多家定值的不确定度(u定=0.014%)。需通过这3部分不确定度合成计算得到合成不确定度(u合成)，

u合成=0.03%。

当置信区间95%时，k=2，扩展不确定度uCRM=2u合成=0.06%。

3 结论

本研究严格按照GB/T 15000.3—2008的要求，对银杏内酯C进行了标准品建立所需要的实验,即均匀性检验、稳定性检验和定值分析，根据这三个方面进行了不确定度的合成和扩展，获得了定值纯度为(99.85±0.06)%的银杏内酯C国家标准样品。该标准样品可用于银杏内酯C的含量测定、纯度检测与质量控制，为银杏、银杏叶及其他含有银杏内酯C药材的成分分析、样品检测、科学研究和产品开发提供了技术支撑和溯源保证。本实验为天然产物研制成国家标准样品起到了补充效果，填补了银杏内酯C标准样品在国内外的空白。