DcR3表达在肝癌细胞凋亡和增殖中的作用研究

董 静 陈 萍 吕艳欣 李鹏辉 王 玉

(齐齐哈尔医学院 黑龙江 齐齐哈尔 161000)

肝癌是一种发生于肝脏的癌症，早期肝癌通常没有任何症状，随着疾病进展，患者可能出现不明原因的体重减轻、食欲不振、少量进食就感觉很饱、反复有恶心或呕吐等症状。肝癌细胞发生的分子机制方面，一般包括了癌基因还有抑癌基因的突变，除了这两个之外，也有生长因子在失控方面的表达等[1]。DcR3属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)的一个成员，这个指标可以采用竞争的方法对相关信号的转导和通路起到阻断的作用，可以对细胞的增殖情况起到调节的作用，控制住细胞的凋亡。基于此，本文通过探究DcR3表达在肝癌细胞凋亡和增殖中的作用，为肝癌细胞分子治疗与预后提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

人肝癌细胞株HepG2、MHCC-LM3、MHCC-97H这些都是从北京中科质检生物技术有限公司提供的，然后DMEM培养液还有胰蛋白酶等是由美国Hyclone公司提供的；上海吉凯基因化学技术有限公司提供的有LV-DcR3、LV-NC这两个物质；美国Abcam公司则是生产了鼠抗DcR3单克隆抗体，武汉艾美捷科技有限公司是生产了鼠抗CADPH单克隆抗体；逆转录试剂盒、荧光定量PCR由日本Takara公司提供。

1.2 方法

(1)细胞培养：肝癌的细胞株里面HepG2、MHCC-LM3、MHCC-97H都是使用了10%浓度的胎牛血清，并对青链霉素DMEM进行培养，剂量都是100U/mL，在37℃的温度下、5%的CO2培养箱里面进行常规的培养；取对数期的细胞，一般情况下每个孔都是3×105个细胞接种，大概是6个孔板；在细胞的密度在80%以上的时候再进行LV-DcR3、LV-NC；在感染之前把培养基扔掉，使用新的，然后根据相关病毒滴度测定的结果加入病毒的上清，大概是MIO 50TU/mL，同样在37℃的温度下、5%的CO2培养箱中常规培养，然后在12小时之后更换培养基，72小时之后观察感染的情况。之后再对相关细胞进行收集并检测蛋白免疫的印记还有细胞生长的曲线。(2)对DcR3蛋白进行检测：使用细胞裂解液将细胞裂解，并使用BCA的蛋白定量试剂盒进行定量之后，把上样缓冲液加进去搅拌均匀之后，在100℃的情况下进行变性，大概10分钟，然后进行10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后开始湿转，大概10分钟，结束之后把其转移到PVDF膜的位置上，再使用脱脂奶粉封闭液进行封闭，浓度大概是5%，时间是2小时；一抗按照比例加入，在4℃的温度下孵育一夜，使用磷酸盐缓冲液进行3次漂洗，每次都是10分钟；然后再进行二抗，需要在室内正常的温度下进行孵育，时间大概是1小时，然后再进行漂洗，也是需要3次，每次的时间减少到5分钟，最后观察检测出来的结果。(3)对mRNA表达的水平进行检测：需要先把细胞里面的RNA提取出来，使用的方法是Trizol，然后再把总RNA的1μg mRNA反转录成cDNA，使用的试剂盒是逆转录试剂盒，转录的时候需要在42℃的条件下进行，时间大概是60分钟，然后在70℃的温度下重复一次，时间是5分钟。qPCR：PCR反应体系为20μL是这个PCR反应的一个体系，一般情况下每个孔都需要3个复空，然后进行预变性，温度是95℃，大概需要2分钟，然后在95℃条件下预变性15秒、60℃的条件下预变性34秒，进行40个循环。

1.3 观察指标

2 结果

2.1 不同肝癌细胞株DcR3蛋白、mRNA表达

经检测发现，HepG2细胞株的DcR3蛋白表达水平要低于MHCC-LM3、MHCC-97H，P<0.05；HepG2在mRNA表达水平中明显低于MHCC-LM3、MHCC-97H，P<0.05，如下表。

表1 不同肝癌细胞株DcR3蛋白、mRNA表达

2.2 上调DcR3表达后凋亡指标转录水平

经检测发现，LV-DcR3组caspase-3、Bax低于LV-NC组，Bcl-2则高于LV-NC组，P<0.05，如下表。

表2 上调DcR3表达后凋亡指标转录水平

3 讨论

在肿瘤的发生和发展里面，DcR3这个指标有着比较重要的作用，而且这个基因也是属于TNFR超家族的一个成员，也就是说该指标和TNFR有着较高的同源性，可以通过一些介导细胞的凋亡，还有蛋白分子的胚体进行结合，这样可以对后者物质介导的细胞凋亡起到阻断的作用[2]。其次，这个基因可以对T细胞进行阻断，也可以对肿瘤细胞的凋亡进行阻断，阻断的方式各式各样，所以这个基因在很多种恶性的肿瘤发生和发展方面有着比较重要的作用。

本次研究里面对DcR3的慢病毒进行建立，并对其表达的水平进行转染，转染成比较低的HepG2细胞，然后再验证转染的效率。不过在对这个基因的表达进行上调之后可以看出，能够进一步促进HepG2这个细胞株在增殖还有抗凋亡方面的能力[3]。Caspase-3在细胞凋亡中起到了重要作用，因为活化的Caspase-3是可以引起细胞凋亡，但是这个过程也是可以被Bcl-2进行阻断[4]。在本次的研究中发现，LV-DcR3组caspase-3低于LV-NC组，可以表明这个基因在肝癌细胞进行凋亡的时间段里面起到了比较重要的作用。本次研究结果中发现，在对这个基因的表达进行下调的时候，可以看出肝癌细胞里面HepG2这个细胞的增殖能力发生了比较明显的下降，也就是说这个指标在一定程度上是可以对相关细胞的增殖进行控制的。但由于相关研究较少，需进一步研究其是如何进行调控，只有这样才可以在-为这个疾病的患者进行治疗的时候提供比较科学的基础。

综上所述，在肝癌细胞进行增殖还有抗凋亡方面，DcR3这个基因都是有着比较重要的作用，因为其和上调抗癌基因的表达方面有着比较密切的关系。