外周血Beclin-1、Atg5表达与老年脓毒症患者预后的相关性*

王 佳,高恒波,林雪容,罗肖宇,陈丽君,韩树池

(1.河北北方学院附属第一医院急诊科，河北张家口 075000;2.河北医科大学 第二医院急诊科，石家庄 050000)

脓毒症是临床常见的危重症，由重症感染、大面积烧伤、大手术引起，可发展为脓毒症休克、多器官功能障碍。老年患者的基础疾病多、各项机体功能退化、免疫功能减弱，发生脓毒症后的预后差，更容易发生多器官功能障碍，救治难度大、死亡率高。在临床实践中，早期判断脓毒症的病情及预后对指导治疗、改善预后具有积极意义。近些年，感染后免疫抑制在脓毒症发病过程中的作用受到越来越多关注，淋巴细胞耗竭是影响脓毒症患者预后的重要因素，与淋巴细胞耗竭相关的机制包括细胞凋亡及自噬等[1-3]。

自噬是由溶酶体介导的细胞内小分子物质降解过程，适度的自噬有利于细胞在严酷环境下的存活。有动物实验报道，脓毒症小鼠体内CD4+T淋巴细胞数目明显减少，激活自噬能够促进CD4+T淋巴细胞的存活，表明自噬在脓毒症的发病过程中对淋巴细胞具有保护作用[4]。另有研究报道，脓毒症患者外周血淋巴细胞中自噬相关蛋白Beclin-1及自噬相关基因5(autophagy-related gene 5，Atg5)表达水平降低与病情加重、预后恶化有关[5-6]，提示脓毒症发病过程中淋巴细胞的自噬受到抑制，进而可能削弱自噬对淋巴细胞的保护作用，引起淋巴细胞数目减少并导致脓毒症病情加重。但目前自噬在老年脓毒症发病及预后评估中的作用尚不清楚。因此，本研究将以自噬为切入点观察外周血自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5表达与老年脓毒症患者预后的相关性，旨在阐明自噬在老年脓毒症发病中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3月至2019年10月河北北方学院附属第一医院收治的136例老年脓毒症患者作为脓毒症组。纳入标准：(1)符合《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南(2018)》[7]中脓毒症的诊断标准；(2)年龄60岁以上；(3)入院后立刻留取外周静脉血标本；(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并恶性肿瘤、血液系统疾病、免疫功能缺陷疾病；(2)入院前正在使用免疫抑制剂或糖皮质激素治疗。选取同期体检且一般资料与脓毒症组匹配的55例健康者作为对照组。脓毒症组男75例、女61例，年龄62～76岁，平均(70.38±9.85)岁；对照组男32例、女23例，年龄60～72岁，平均(68.28±11.45)岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究取得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1外周血Beclin-1、Atg5表达的检测

取脓毒症组和对照组的外周静脉血5 mL，采用淋巴细胞分离液(上海碧云天公司)分离淋巴细胞，而后加入RIPA裂解液(上海碧云天公司)裂解淋巴细胞、提取蛋白，采用BCA试剂盒(上海碧云天公司)检测蛋白水平，将含有30 μg蛋白的标本用于Western blot实验。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离蛋白，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶室温孵育PVDF膜1 h，1∶1 000稀释的Beclin-1、Atg5一抗(英国Abcam公司)或1∶2 500稀释的β-actin一抗(美国Sigma公司)4 ℃孵育PVDF膜过夜，洗膜3次后室温孵育1∶2 000稀释的二抗1 h，最后在凝胶成像仪(美国Bio-rad公司)中显影得到蛋白条带，根据条带灰度值、以β-actin为内参计算Beclin-1、Atg5的表达水平。

1.2.2临床资料收集

查阅脓毒症患者的病历，收集以下临床资料：性别，年龄，既往病史[高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)]，生命体征(体温、收缩压、舒张压)，入院24 h的实验室检查指标[白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、血小板计数、血红蛋白、清蛋白、血肌酐、C反应蛋白、降钙素原，计算中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil lymphocyte ratio，NLR)、血小板/淋巴细胞比值(platelet lymphocyte ratio，PLR)、单核细胞/淋巴细胞比值(monocyte lymphocyte ratio，MLR)]，根据入院后24 h内各项指标的最差值计算急性生理和慢性健康评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)。

1.2.3预后情况判断

查阅脓毒症患者的病历，根据入院后28 d的病情判断预后(包括存活和死亡)，自动出院或临终前放弃的患者均视作死亡。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组外周血Beclin-1、Atg5表达水平比较

与对照组比较，脓毒症组外周血Beclin-1、Atg5的表达水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。

图1 Western blot检测外周血Beclin-1、Atg5的表达情况

2.2 脓毒症组存活与死亡患者外周血Beclin-1、Atg5表达水平比较

与存活患者比较，脓毒症组死亡患者外周血Beclin-1、Atg5表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 外周血Beclin-1、Atg5预测脓毒症患者预后的Kaplan-Meier曲线及ROC曲线分析

按照脓毒症组外周血Beclin-1、Atg5表达水平的中位数将其分为高表达和低表达患者，经Kaplan-Meier曲线分析，与Beclin-1、Atg5低表达患者比较，高表达患者的28 d累积生存率明显增加(P<0.05)。绘制外周血Beclin-1、Atg5表达预测脓毒症患者预后的ROC曲线，曲线下面积分别为0.611(95%CI：0.512～0.709，P=0.030)、0.626(95%CI：0.532～0.720，P=0.013)，见图2。

表1 两组外周血Beclin-1、Atg5表达水平比较

2.4 脓毒症组存活与死亡患者临床资料比较

与脓毒症组存活患者比较，死亡患者的性别、年龄、高血压、冠心病、糖尿病、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、清蛋白、C反应蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)，但NLR、PLR、MLR、血肌酐、降钙素原、APACHEⅡ明显增加(P<0.05)，见表3。

表2 脓毒症组存活与死亡患者外周血Beclin-1、Atg5表达水平比较

2.5 脓毒症预后的COX回归分析

以脓毒症预后作为因变量，以存活与死亡患者比较差异有统计学意义的因素作为自变量进行COX回归分析。结果显示：NLR、MLR、Beclin-1、Atg5、APACHEⅡ是脓毒症预后的影响因素(P<0.05)，见表4。

A：Kaplan-Meier曲线；B：ROC曲线；C：Kaplan-Meier曲线；D：ROC曲线。

表3 脓毒症组存活与死亡患者临床资料比较

表4 脓毒症预后的COX回归分析

2.6 外周血Beclin-1与Atg5联合指标预测脓毒症预后的logistic回归与ROC曲线联合分析

在logistic回归模型中生成Beclin-1联合Atg5预测脓毒症组患者预后的新指标为2.426-2.456×Beclin-1-2.566×Atg5，绘制Beclin-1与Atg5联合指标预测脓毒症组患者预后的ROC曲线，曲线下面积为0.672(95%CI：0.582～0.762，P=0.001)，见图3。

图3 Beclin-1与Atg5联合指标预测脓毒症组患者预后的ROC曲线

3 讨 论

近些年脓毒症的临床救治进展迅速，1 h内使用抗生素、早期液体复苏、多器官功能支持等治疗手段的应用使脓毒症的死亡率明显降低。尽管如此，老年脓毒症患者的救治难度仍较大，受到基础疾病多、免疫力低下等因素的影响，患者更易发生多器官功能障碍、死亡率较高。近来越来越多的学者关注到感染后免疫功能抑制对脓毒症患者预后产生不利影响，阐明免疫抑制发生机制、靶向增强免疫功能可为提高脓毒症救治成功率提供帮助。

淋巴细胞是在免疫应答中发挥重要作用的一类细胞，多项临床研究报道淋巴细胞减少、NLR增加与脓毒症的发生及预后的恶化有关[8-10]。自噬是脓毒症发病过程中与淋巴细胞减少密切相关的生物学环节，自噬是溶酶体降解蛋白质、细胞器并进行再利用的过程，有利于维持细胞稳态，使细胞在感染、应激等病理因素作用下存活。脓毒症的两项动物实验证实了自噬对淋巴细胞存活的调控作用。WANG等[11]研究显示激活自噬能够促进脓毒症小鼠体内淋巴细胞存活。YING等[12]研究显示抑制自噬能够促进脓毒症小鼠体内淋巴细胞凋亡，提示自噬在脓毒症发病过程中对淋巴细胞具有保护作用。结合国内相关临床研究发现的脓毒症患者淋巴细胞自噬蛋白Beclin-1、Atg5表达减少与预后恶化相关进行分析，脓毒症发病过程中自噬受抑制不利于其发挥淋巴细胞的保护作用，进而引起淋巴细胞减少、脓毒症病情加重[5-6]。

本研究以老年脓毒症患者为对象，分析了自噬与脓毒症发病及预后的关系。老年脓毒症患者外周血中Beclin-1、Atg5的表达明显减少且存活患者外周血中Beclin-1、Atg5的表达明显高于死亡患者，表明在老年脓毒症的发病过程中外周血淋巴细胞的自噬受到抑制且死亡患者自噬受抑制的程度更强，其机制可能是自噬受到过度抑制后淋巴细胞存活减少、免疫功能减弱并造成预后恶化。进一步通过Kaplan-Meier曲线及ROC曲线分析Beclin-1、Atg5表达与老年脓毒症患者预后的关系，随着Beclin-1、Atg5表达增加，老年脓毒症患者的28 d累积生存率也相应增加且Beclin-1、Atg5的表达对预后具有预测价值，由此进一步验证了Beclin-1、Atg5在老年脓毒症患者病情发展变化中的保护作用。

脓毒症患者预后的影响因素复杂，国内外多项研究报道NLR、MLR及APACHEⅡ等辅助检查指标是脓毒症患者预后的影响因素[13-16]。本研究也对老年脓毒症患者预后的影响因素进行了分析，结果发现Beclin-1、Atg5、APACHEⅡ与患者预后相关，其中NLR、MLR、APACHEⅡ与预后相关的结果与既往多项研究的报道一致，但APACHEⅡ过程复杂、依赖多项辅助检查指标，不利于病情的早期评估。Beclin-1、Atg5与预后相关的结果与Kaplan-Meier曲线及ROC曲线分析的结果一致，在此基础上本研究还分析了两项指标联合评价预后的价值，在logistic模型中得到方程后生成Beclin-1联合Atg5的新指标，经ROC曲线分析：该新指标对老年脓毒症患者的预后具有预测价值且曲线下面积较单一指标增加，提示联合指标对老年脓毒症患者预后的评估价值优于单一指标。

综上所述，老年脓毒症患者外周血自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5表达减少且与预后恶化有关，Beclin-1联合Atg5用于评估老年脓毒症患者的预后具有更优的灵敏度和特异度，一方面为今后评估老年脓毒症病情、将自噬标志蛋白作为评价预后的标志物提供了依据，另一方面也为今后探明自噬在脓毒症发病中的作用机制、发现通过自噬治疗脓毒症的新手段提供了思路。但本研究的样本量相对较少，仍需在今后的研究中继续增加样本量来寻找更优的截断值以提高联合检测的灵敏度和特异度。