细胞直接接触对新生血管生成调控作用的研究*

余 杨，吴洪坤，罗永金，喻鹏凌，何 勇，陈 灏

(中国科学院大学附属重庆医院/重庆市人民医院心血管外科 401121)

缺血性心脏病是目前全球范围内主要的致死性疾病之一[1]。梗死心脏的功能性恢复主要依赖于侧枝血管网的重建，以供给足够的含氧血液[2]。尽管缺血早期的再灌注治疗(如外科手术、安装支架)明显降低了致死率，但要恢复并维持心肌正常功能仍然依赖于血管的再生，这也是促血管化治疗缺血性心脏疾病的主要策略和目标[3]。虽然血管生成和血管生成相关因子已被广泛研究，但促血管生成机制及通路十分复杂，仍未得到完全阐明[4]。故本研究拟建立有效的体外三维细胞培养模型，探寻再血管化的具体调控机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)实验动物：6～8周龄雄性C57BL/6小鼠10只及1～2 d新生雄性C57BL/6小鼠20只，由陆军军医大学实验动物中心提供。(2)细胞：雄性C57BL/6小鼠肺脏分离、纯化出的肺微血管内皮细胞及由其心脏分离出的心肌细胞和心肌成纤维细胞。(3)主要试剂：胰蛋白酶、DMEM/H完全培养基、10%胎牛血清购自美国Gibco公司；胶原酶Ⅱ购自美国Worthington公司；多肽水凝胶购自上海翌圣公司；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TMRITC)购自北京百灵威公司；山羊抗兔IgG抗体购自美国Sigma公司；兔抗鼠特异性CD31抗体购自美国BD公司。(4)主要仪器：荧光显微镜(德国Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1原代细胞分离

6～8周雄性C57BL/6小鼠断髓法处死，暴露胸腔，迅速取出肺脏并切碎，在JAVED等[5]实验的基础上，采用酶消化及免疫磁珠分选法分离、纯化小鼠肺微血管内皮细胞，保存备用。

1～2 d新生雄性C57BL/6小鼠断髓法处死，取心脏，充分绞碎，室温下分别依次置于0.1%胰蛋白酶及0.08%胶原酶Ⅱ中约7 h，彻底消化。吸出细胞悬液，于细胞培养皿中静置约2 h，以便于非心肌细胞黏附贴壁[6]。剩余细胞悬液(含心肌细胞)吸出保存备用。

1～2 d新生雄性C57BL/6小鼠断髓法处死，解剖暴露心脏，将其取出，磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)反复清洗后，剪成碎末，室温下于0.25%胰蛋白酶中充分混匀、消化，并静置后吸出上清液，加入20% DMEM/H完全培养基，终止胰蛋白酶反应，置于细胞培养箱(37 ℃，50% CO2)孵育40 min。滤网过滤，弃去未消化的组织碎粒，1 500 g超速离心机离心5 min，弃去上清液，加入适量PBS，反复吹打后，再次离心，由此2～3次，最后将分离并富集的心肌成纤维细胞加入培养基中孵育并保存备用[7]。

1.2.2三维细胞培养

各类细胞按以下方式分组：内皮细胞+血管内皮生长因子组、内皮细胞组、内皮细胞+心肌细胞组和内皮细胞+心肌成纤维细胞组。

具体三维培养方法如下：各组细胞分别接种在置于培养皿中的1%多肽水凝胶支架(多肽序列： AcN-RARADADARARADADA-CNH2)上[8]。内皮细胞+血管内皮生长因子组及内皮细胞组内皮细胞接种密度为1.4×106/cm2；内皮细胞+心肌细胞组及内皮细胞+心肌成纤维细胞组两种细胞按1∶1接种，各细胞接种密度均为0.7×106/cm2。将10%胎牛血清加入接种于多肽水凝胶支架的各组细胞中(内皮细胞+血管内皮生长因子组中胎牛血清含血管内皮生长因子)，置于细胞培养箱中孵育7 d，每2天更换1次细胞培养基。

1.2.3免疫荧光细胞染色

于细胞培养箱中取出上述4组经三维培养的细胞培养皿，弃去剩余培养基，0.01 mmol/L pH 7.4 的PBS反复清洗3次，吸去残留液体。加入100%冷丙醛37 ℃下固定10 min，PBS洗3次，每次5 min。再加入兔抗鼠特异性CD31抗体(1∶100)，37 ℃下作用30 min，弃去残留一抗，PBS漂洗3次，每次5 min，最后加入四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tetramethylrhodamine isothiocyanate，TMRITC)标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶200)，37 ℃下作用30 min，弃去残留二抗，PBS漂洗3次，每次5 min。滴加甘油缓冲液后，直接于荧光显微镜下镜检，并摄片记录[9]，呈红色荧光为阳性表达。

2 结 果

内皮细胞组内皮细胞和细胞间相互交联无明显增生，无明显血管网状结构形成；内皮细胞+血管内皮生长因子组、内皮细胞+心肌细胞组及内皮细胞+心肌成纤维细胞组内皮细胞明显增生，细胞间相互交联增多，形成了较多的血管网状结构，见图1。

A：内皮细胞+血管内皮生长因子组；B：内皮细胞组；C：内皮细胞+心肌细胞组；D：内皮细胞+心肌成纤维细胞组。

3 讨 论

缺血性心脏病是由于冠状动脉粥样硬化性改变引起血管管腔狭窄或闭塞，造成冠状动脉血流供应与心肌需求间失衡，从而导致缺血性心肌损伤的一大类疾病总称[10]。心肌缺血会导致心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、恶性心律失常，甚至猝死[11]。且长期缺血、缺氧会导致心肌弥漫性纤维化，可造成心肌收缩和舒张功能障碍，此时即使心肌血运恢复，其疾病进程也无法逆转[12]。MORAN等[13]通过研究指出，自20世纪90年代开始，全球年龄标准化的心肌梗死发病率、心绞痛患病率、全球大部分地区年龄标准化缺血性心脏病死亡率有所降低，缺血性心力衰竭患病率则升高，但由于人口增长和老龄化的影响，近年来全球缺血性心脏病的疾病负担明显增加，现已占据全球死亡原因的第1位。因此，研究心肌重塑过程中血管生成的分子机制，促进早期间质血管网再生，对有效延缓并逆转该类疾病有重大的实际临床意义。

血管生成是在促进因子和抑制因子的共同作用下，内皮细胞激活、增殖、迁移，最终形成新生血管和血管网的过程[14]。已发现的血管生成促进因子主要包括血管内皮细胞生长因子家族、成纤维细胞生长因子家族及转移生长因子家族等20多种[15]，而抑制因子包括凝血酶敏感蛋白1、干扰素ɑ/β、血管抑素、16×103泌乳素、血小板因子4等300种[16]。在正常生理条件下，此过程的调控是由这两种因子之间的平衡实现的，通常抑制因子的作用要强于促进因子。当心肌组织在物理的(压力或容量超负荷)、化学的(缺血或缺氧)及代谢的(多种代谢产物)因素作用下，这一平衡被打破，血管生成因子启动，通过众多细胞信号通路，如Notch信号通路、Netrin1-CD146信号通路、转移生长因子-β信号通路等，以及其一系列复杂的分子生物学反应而使细胞外基质降解，内皮细胞激活、增殖、迁移形成管腔，最后结合相应平滑肌细胞和周围细胞构成完整的血管网状结构，以使病变组织的微血管密度增加、改善，甚至恢复其氧气和营养供应[17]。

综上所述，虽然血管生成的分子机制及其通路被广泛研究，且很多已被证实[18]，但具体调节过程十分复杂，该领域仍需进一步的研究探讨。本实验另辟蹊径，通过血管内皮细胞、心肌细胞、心肌成纤维细胞的体外三维培养，结果发现：在内皮细胞与心肌细胞、内皮细胞与心肌成纤维细胞共培养的条件下，去除血管内皮生长因子依然能促进内皮细胞增殖并交联形成完整的血管网络。该研究揭示了细胞间直接接触的促血管化功能，解答了血管生成调节领域内的又一个疑问，为进一步探讨细胞间相互作用在血管生成及其他生理和病理环境下的功能奠定了基础。