内质网应激对T细胞抗肿瘤功能调控的研究进展

王铮豪，高亚凤，张连军，刘 畅

（1中国药科大学生命科学与技术学院，南京 211198；2中国医学科学院北京协和医学院苏州系统医学研究所，苏州 215123）

内质网是胞内蛋白质折叠、成熟和运输的主要场所。哺乳动物约三分之一的新生多肽链需要经过内质网的加工和转运，故生理状态下，内质网腔中分布着成千上万种不同状态的多肽链和新生蛋白。为了确保蛋白质在内质网网腔中有条不紊地进行正常修饰、折叠和转运，内质网进化出了强大的蛋白质质量控制系统。该系统可感知细胞的蛋白折叠负荷以及网腔中未折叠及错折叠的蛋白质，来调控内质网的蛋白质折叠能力和内质网相关蛋白质降解（endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD）。在不利的细胞内外环境等多重因素的影响下，蛋白质的正确折叠被阻滞或破坏，未折叠蛋白和错误折叠蛋白在胞内累积，诱发细胞强烈的内质网应激［1］。在内质网膜上，有3类跨膜蛋白［2］：蛋白激酶RNA 样内质网激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、肌醇需求酶1α（inositol-requiring enzyme 1 α，IRE1α）和活化转录因子 6（activating transcription factor 6，ATF6），它们作为内质网应激的感受器［3］，可以触发未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）来增强内质网的蛋白折叠能力，抑制新生蛋白的合成并促进错折叠蛋白的降解，维持内质网稳态。

T 细胞在胸腺发育成熟，先后经历CD4-CD8-双阴性阶段和CD4+CD8+双阳性阶段，最后分化为成熟的CD4+T细胞和CD8+T细胞输出到外周淋巴器官［4］。CD4+T细胞被抗原刺激激活，在特定条件下可以分化为Th1、Th2 和Th17 等细胞，进而发挥不同免疫调节作用［5］。CD8+T细胞具有杀伤功能，在抗肿瘤免疫功能中发挥重要作用，它在激活并分化为效应CD8+T 细胞后分泌穿孔素和颗粒酶杀伤肿瘤靶细胞，以及其他的细胞因子如IFNγ、TNFα等发挥抗肿瘤功能［6］。

众多研究表明，肿瘤细胞发生内质网应激以提高内质网的蛋白质加工能力进而满足自身增殖和代谢需求，促进肿瘤进展［7］。T 细胞在细胞内外复杂因素的作用下，也会发生一定程度的内质网应激。低强度的内质网应激可以加强细胞对应激的抵抗力和适应性，促进细胞存活；高强度的内质网应激则会诱导细胞死亡［8］。T 细胞在不同的发育和分化阶段，以及不同的微环境中，3 种感受器的激活状态和下游信号通路的激活也不一样，因此T 细胞受影响的程度也不尽相同。在T 细胞中，内质网应激的发生与T细胞功能的调控密切相关。本文结合国内外最新研究进展，对内质网应激调控T细胞的抗肿瘤功能进行论述。

1 内质网应激信号通路转导

免疫球蛋白结合蛋白（binding-immunoglobulin protein，BiP）是内质网膜上的一类驻留蛋白，是Hsp70 伴侣蛋白家族中的一种。在正常生理情况下，BiP 与内质网膜上的3 类传感器结合以抑制它们的激活。但是在内质网应激发生时，BiP 与错折叠蛋白具有更高的亲和力，因而从传感器上解离下来。与BiP 解离的3 类传感器被激活，进一步介导下游信号通路的活化［8］。

1.1 PERK信号通路转导

PERK是真核翻译起始因子2亚基α（eukaryotic translation initiation factor 2 subunit-α，eIF2α）的激酶，PERK 感应到内质网应激信号后，迅速磷酸化eIF2α［2］，以减少新生蛋白的合成来降低内质网蛋白折叠的负荷［9］。磷酸化的 eIF2α 抑制 5'帽依赖的翻译来减少蛋白的合成［10］，但是某些基因的mRNA 在其5'非编码区中包含小的开放阅读框，可以绕过依赖于eIF2α 的翻译区，激活转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）就是其中之一［11］。ATF4 是一种应激转录因子，参与细胞氨基酸代谢、蛋白质合成、凋亡和自噬的调控［12］。一方面，ATF4 直接与促凋亡转录因子C/EBP 同源蛋白（pro-apoptotic transcriptional factor C/EBP homologous protein，CHOP）的启动子结合并激活其转录，诱导细胞发生凋亡［13］；另一方面，ATF4 通过上调蛋白磷酸酶 1（protein phosphatase 1，PP1）调控DNA 损伤诱导基因 34（DNA damage-inducible gene 34，GADD34），参与负反馈调节环路，使eIF2α 去磷酸化，以恢复蛋白合成［14］。

1.2 IRE1α信号通路转导

3 种内质网应激感受器中，IRE1α 在进化上高度保守，在植物和酵母细胞中也都有发现［15］。IRE1α被激活后发生寡聚化和磷酸化［16］，从而发挥激酶活性，切割胞浆中X-box 结合蛋白1（X-boxbinding protein 1，XBP1）mRNA 内含子上的 26 个核苷酸片段［17］，这一过程导致 XBP1 转录水平活化（spliced XBP1，XBP1s），XBP1s 可以上调内质网中与蛋白易位、折叠和分泌相关的基因，以及降解错误折叠蛋白基因的表达［2］。其中，内质网降解增强α-甘露糖苷酶样蛋白（ER degradation-enhancing αmannosidase-like protein，EDEM）是定位在内质网膜上的一类跨膜蛋白，其蛋白水平依赖于IRE1α/XBP1s 通路的调控。EDEM 通过将错折叠蛋白靶向到ERAD进行降解，从而降低内质网蛋白折叠负荷［18］。同时，ERAD 相关组成蛋白的上调也受到XBP1s的调控，在内质网应激条件下降解错折叠蛋白以维持内质网的蛋白质质量控制［1］。DNAJB9［DnaJ Heat Shock Protein Family（Hsp40）Member B9］、DNAJB11（DnaJ Hsp40 Member B11）以 及DNAJC3（DnaJ Hsp40 Member C3）都是定位在内质网膜上的蛋白，并且受到XBP1s 的激活和调控，显示出HSP40 样ATP 酶活性来增强HSP70 伴侣蛋白家族的功能，促进蛋白质的正确折叠［19］。此外，IRE1α还通过受调控的IRE1依赖性衰减（regulated IRE1- dependent decay，RIDD）来切割 mRNA 和前体microRNA，诱导其降解［20］，降低翻译负荷。

1.3 ATF6信号通路转导

在内质网应激条件下，ATF6 会转位到高尔基体，在高尔基体被位点1 蛋白酶（site-1 protease，S1P）和位点2 蛋白酶（site-2 protease，S2P）切割，释放出N 端具有转录活性的片段ATF6P50 发挥作用［21-22］。 ATF6P50 受 到 XBP1s 的 协 同 调 控［23］，ATF6P50 进入细胞核后，可以调控编码内质网中能够促进蛋白转位、折叠、成熟和分泌相关伴侣蛋白和酶的基因转录［24］，其中大多数是内质网驻留伴侣蛋白（例如BiP）、帮助蛋白质二硫键形成的PDI（protein disulfide isomerase）和 ERAD 相关蛋白组件，以恢复内质网蛋白质折叠功能［25］。

2 内质网应激对T细胞抗肿瘤功能的调控

2.1 PERK对T细胞抗肿瘤功能的调控

许多研究表明，PERK 通路的激活会抑制T 细胞的抗肿瘤功能。研究表明，卵巢癌临床患者肿瘤组织浸润的CD8+T 细胞PERK 通路活化，随后ATF4 表达的升高上调细胞中 CHOP 的表达［26］。CHOP可以直接结合到TBX21启动子上，从转录水平抑制TBX21 的表达。TBX21 作为T 细胞功能的主要调节因子之一，可以调控IFNγ的表达和分泌。抑制内质网应激的发生或者阻断CHOP 的表达可以显著改善CD8+T 细胞的抗肿瘤功能，同时可增强T细胞活化、增殖和存活的相关信号。

Hurst 等［27］研究发现，肿瘤浸润的 CD8+T 细胞表现出强烈的PERK 通路激活，通过活化的PERK/CHOP/ERO1α 信号轴导致线粒体活性氧（mitochodrial reactive oxygen species，mtROS）和 PD-1 表达升高，最终导致瘤内浸润的CD8+T 细胞耗竭。这提示PERK通路的激活会促进CD8+T细胞的耗竭，降低其抗肿瘤免疫功能。由于mtROS 的累积会引发CD8+T细胞的耗竭，基于他们PERK通路的抑制会降低 CD8+T 细胞 mtROS 的水平，Hurst 等［27］给荷瘤小鼠灌胃PERK 抑制剂1 周后，发现瘤内浸润CD8+T 细胞的mtROS 水平显著降低，同时瘤内浸润CD8+T 细胞数量显著上升。由于他们发现PERK 通路活化上调CD8+T 的PD-1，故他们将PERK 抑制剂和PD-1 抑制剂联合给荷瘤小鼠灌胃，发现联合用药的小鼠的肿瘤生长比单独PERK抑制剂或单独PD-1 抑制剂给药的小鼠更加缓慢，且联合给药组的小鼠生存率可达100%，显著高于单独PD-1抑制剂给药组的28%。

调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）是CD4+T细胞的一个亚群，在保持免疫系统对外源抗原和自身抗原的反应平衡起着重要调节作用［28］。有研究发现［29］，在毒胡萝卜素诱导的内质网应激条件下，Tregs 中 PERK 通路被激活，上调下游 p-eIF2α和ATF4 信号分子，使得Tregs 受TCR 刺激后活性增强，导致 IL-10 和 TGF-β 合成和分泌增加，最终具有更强的免疫抑制功能。

因此，PERK 信号通路在T 细胞中的激活对T细胞的抗肿瘤功能的发挥是不利的。通过药物抑制PERK在T细胞中的激活可以有效改善T细胞的抗肿瘤功能，这也成为免疫治疗的一个潜在靶点，具有深入研究的价值。

2.2 IRE1α对T细胞抗肿瘤功能的调控

近期研究显示，IRE1α/XBP1 通路能够调控T细胞的抗肿瘤免疫。Song 等［30］报道，在卵巢癌患者的腹水中，T 细胞中XBP1s水平显著上调。进一步研究表明，卵巢癌患者腹水可抑制CD4+T 细胞表面的葡糖转运体，阻碍葡萄糖的摄取，细胞内过低的葡萄糖水平会抑制己糖胺途径，导致蛋白质的N-糖基化修饰显著减少，因而诱发IRE1α/XBP1通路的活化。XBP1s 通过增强ERAD 介导的谷氨酰胺转运体降解，减少CD4+T 细胞表面的谷氨酰胺转运体，抑制T细胞线粒体呼吸所需的谷氨酰胺的流入，进而抑制T 细胞内IFNγ 的合成，最终降低T细胞的抗肿瘤功能。抑制IRE1α/XBP1信号轴的激活，或者提高谷氨酰胺转运体的表达可以显著提高T细胞的线粒体呼吸和抗肿瘤能力。

此外，Ma 等［31］发现浸润到小鼠黑色素瘤组织的CD8+T 细胞表面耗竭标志物PD-1、TIM-3与T 细胞内累积的胆固醇量呈现正相关性。芯片分析表明胆固醇的积累诱发CD8+T 细胞内质网应激，上调XBP1s 的表达。他们发现高表达的XBP1s 能够提高PD-1 和2B4 的水平，诱导CD8+T 细胞耗竭。使用药物抑制CD8+T 细胞的XBP1s，或者利用他汀类药物降低细胞中的胆固醇积累则能显著提高CD8+T细胞的抗肿瘤功能。

因此，控制内质网应激或者靶向抑制IRE1α/XBP1信号通路可能有助于恢复肿瘤浸润T细胞的代谢适应性和抗肿瘤能力。

2.3 ATF6对T细胞抗肿瘤功能的调控

与 PERK 和 IRE1α 不同的是，ATF6 对 T 细胞的调控功能鲜有报道。Wu 等［24］发现 ATF6 敲除并不影响内质网伴侣蛋白基础表达，也不干扰胚胎期和出生后小鼠的发育。与此形成鲜明对比的是，IRE1α 敲除或者XBP1s 敲除都是胚胎致死性的［32］。但是随着研究的深入，ATF6 的功能被逐渐报道。在肠道上皮细胞中，ATF6 总蛋白量和被剪切的活性N 端片段的增加被证明可以促进肠道微生物的生态失调和微生物依赖性结直肠癌的发生［33］。在急性肝损伤早期，ATF6 信号促进巨噬细胞来源的IL-1α 生成参与肝纤维化形成［34］。在髓系细胞中，ATF6 的敲除可以特异性抑制多形核MDSCs（PMN-MDSCs）而不是单核细胞样MDSCs（M-MDSCs）的免疫抑制活性，降低了PMN-MDSCs在肿瘤微环境中的免疫抑制作用，进而抑制肿瘤的生长［35］。但是，ATF6 是否调控 T 细胞的发育和功能尚未被报道，这将会是内质网应激调控T细胞功能的一个新领域，值得研究者们的深入挖掘。

3 药物靶向内质网应激提高T细胞功能

内质网应激参与糖尿病和多种器官纤维化的病理进程，癌细胞内质网应激的发生也会加速肿瘤进展，因此针对内质网应激已经有多种抑制剂被开发和报道［36］。由于T 细胞发生内质网应激会损害其抗肿瘤功能，因此抑制内质网应激来恢复T细胞功能的研究也已经有所进展。PERK 抑制剂GSK2606414的使用可以促进T细胞在小鼠体内的存活，缓解T 细胞耗竭，提高PD-1 抗体的抗肿瘤疗效［27］。IRE1α 在自身磷酸化后发挥核糖核酸内切酶的活性，剪切XBP1的mRNA。因此，针对IRE1α的磷酸酶和内切酶的活性，研究者们开发出了针对不同靶点的抑制剂。4µ8C 和STF-083010 均能抑制IRE1α 内切酶的活性，导致下游XBP1s 功能失活。IRE1α 的抑制剂被报道可以抑制由内质网应激诱发的肝脂肪变性［37］，在肿瘤微环境中抑制巨噬细胞向 M2 型分化，减缓肿瘤进展［38］。在 T 细胞中，Song 等［30］利用 4µ8C 抑制 IRE1α，显著改善了暴露于卵巢癌腹水的人CD4+T 细胞的抗肿瘤功能。而STF-083010 被报道可以降低荷瘤小鼠肿瘤浸润 CD8+T 细胞 XBP1s、PD-1 和 2B4 的表达，有效减轻肿瘤负荷，提高CD8+T细胞抗肿瘤功能。

自第一个靶向内质网应激的药物硼替佐米用于临床以来［39］，越来越多的化合物被研究发现能够针对特定的信号通路发挥作用。然而，尽管这些药物（例如GSK2656157）在临床前实验中能够观察到较好的肿瘤抑制作用，但是由于它们的靶向性较差，无差别抑制内质网应激反应信号通路会损害一些蛋白合成需求较大的分泌细胞的功能如胰岛β 细胞［40］。研究发现，这种损伤的发生是由1 型干扰素介导的，抑制1 型干扰素受体的激活可以有效缓解PERK 抑制剂带来的胰腺功能损伤［41］。在临床上，1 型干扰素受体抑制剂被用于治疗系统性红斑狼疮患者，但是还没有将两种药物联合使用的报道出现。如果在PERK 抑制剂使用的同时给予1 型干扰素受体抑制剂，有效缓解PERK 抑制剂对胰腺细胞的不良反应的话，这将是加快靶向内质网应激药物的临床推进的一大助力。

4 生物钟和内质网应激

哺乳动物为了适应昼夜变化，进化出完整的生物钟系统来调节机体的生理活动，故时钟基因在各种组织细胞中均有表达［42］。尽管如此，生物钟在T 细胞中的研究相对较少。近年来有报道，CD8+T 细胞可以通过生物钟来调控接种疫苗后的免疫反应［43］。在EAE 模型中，PERK/p-eIF2α/ATF4通路活化能够促进CD4+T 细胞向TH17 细胞分化［44］。有趣的是，TH17 细胞的分化调控也受到生物钟网络的调节［45］，故生物钟网络与内质网应激对T细胞分化与功能的调控可能有平行的部分。

在T 细胞以外，生物节律通过内质网应激PERK 通路的激活介导肝脏衰老［46］，NIH-3T3 细胞通过ATF4 依赖的方式抑制昼夜节律和生物钟控制基因的转录［47］。另一方面，生物钟紊乱被报道与多种癌症的发生密切相关［48］。肿瘤发生时，T细胞中Per（period）基因家族表达的降低与肿瘤的进展呈现正相关性［48］。肿瘤微环境浸润T 细胞的IRE1α被高度激活后，Per1基因编码的mRNA 受到IRE1α核酸内切酶的切割而失去活性［49］；Per2时钟基因的启动子区域也被发现存在XBP1s 的结合位点［50］，提示着 Per2 的转录也可能受到 XBP1s 的调控。在耗竭T细胞中，Per2等时钟基因的表达降低伴随着免疫抑制分子如 PD-1，CTLA-4 的升高［51］。除了 IRE1α 通路以外，PERK 通路下游的 ATF4 也可以与Per2 启动子区域的ATF4 基序结合，调控Per2 基因的转录［52］。因此，内质网应激被调控的同时，可能对生物钟相关的基因表达也会产生影响。靶向内质网应激的IRE1α 和PERK 信号通路，来调控Per1 和Per2 的表达，具有恢复肿瘤浸润T细胞生物节律的潜力，或许可以借此改善T细胞抗肿瘤免疫功能。目前，人们对内质网应激与生物钟之间的交互作用对T 细胞抗肿瘤功能的调控知之甚少，相关的机制还需进一步研究。

5 讨论和展望

内质网应激已在许多癌症中被证实参与肿瘤的发生和发展。肿瘤微环境低氧、低糖、低pH 和氧化应激等不利因素，以及肿瘤细胞自身过度的蛋白质合成需求诱发肿瘤细胞内质网应激，激发肿瘤细胞适应性的未折叠蛋白反应和强大的增殖潜力，加快肿瘤的生长［53］。然而，肿瘤微环境这些不利的因素诱发T 细胞内强烈而持久的内质网应激，加剧T细胞的耗竭，减少细胞因子的分泌，进而损害T 细胞的抗肿瘤免疫功能。在内质网应激和生物节律的协同调控下，T细胞能够更好地发挥其抗肿瘤免疫功能。利用药物靶向抑制T 细胞中内质网应激相关通路，一方面可以直接改善T细胞内部的应激环境，另一方面也能通过调控T细胞的时钟基因，缓解T细胞耗竭，增强抗肿瘤功能。因此，内质网应激的靶向药物有着广阔的临床应用前景。但在非肿瘤模型中，内质网应激的发生对T细胞有着不一样的调控作用。在急性感染模型中，IRE1α/XBP1s 信号轴的激活有助于终末效应CD8+T细胞的分化［54］。这意味着在不同背景下，内质网应激对T 细胞的功能调控需要重新评估。由于内质网应激反应的保守性，各种细胞都会受到内质网应激的调控。研究肿瘤微环境中浸润的各类细胞对内质网应激调控信号的响应，而不仅仅是T细胞，对未来免疫疗法的改善具有深远的意义。