神经细胞三维培养技术研究进展

关冀弛 刘丹 陈艳阁 樊雪 汪海峰

(1 沈阳化工大学制药与生物工程学院，辽宁 沈阳 110142； 2 辽宁成大生物股份有限公司)

神经细胞二维(2D)贴壁培养是传统的神经细胞体外培养方法，常应用于神经细胞Neuro-2A[1]、SH-SY5Y[2]和PC12[3]等的培养。这种2D培养方法成本低、操作简便，且细胞生长快，易于大规模培养。然而，正常的神经系统是由神经元和神经胶质细胞在三维(3D)空间形成的，2D细胞培养不具备体内神经细胞生长的环境，难以模拟细胞-细胞和细胞-细胞外基质(ECM)之间的相互作用[4-5]，因此可能会对神经细胞的部分基因、蛋白表达产生影响。而通过选取利于神经细胞生长的培养材料和方法，可以更加深入地揭示神经系统疾病发病机制，同时有助于特异性药物研发。

3D细胞培养技术能使细胞在3D空间中生长并发生相互作用，使细胞群形成一个3D立体结构。其优势是在空间方面克服了2D培养方式的弊端，能最大程度地模拟神经细胞的立体结构，充分发挥细胞的功能，同时还可支撑神经细胞的黏附和伸展分化。3D细胞培养技术不仅能模拟脑部高度复杂化的3D神经网络结构，还能进一步分析脑内炎症情况[6]。目前，神经细胞的3D培养技术可分为两大类：无支架培养法和支架培养法。

1 无支架培养法

无支架培养法是以细胞本身的附着力为基础，使细胞聚集成3D结构。主要包括以下几种方法：神经球法、悬滴培养法、微重力旋转式细胞培养法(RCCS)及磁性纳米粒子培养法等。

1.1 神经球法

将神经细胞聚集成团状物细胞集合体，在3D环境下形成细胞球[7]。这种培养方式操作便捷、易于大规模培养。然而这种培养方式存在一定的不足：大量神经细胞集中于“神经球”的内部，缺乏运输养分和代谢产物的通道。随着“神经球”的不断增大，“神经球”内部营养物质和代谢物的交换会出现困难，影响内部细胞进一步增长，甚至使内部细胞发生凋亡及坏死，出现中空的现象。因此这种方法培养的神经细胞体积会受到限制，神经球的培养周期和药物处置时间亦不能太久。

1.2 悬滴培养法

利用表面张力将细胞悬液滴置于培养皿或者培养板底部，然后翻转培养，使液滴内部的细胞在重力及细胞间附着力的作用下聚集成3D结构[8]。此方法操作比较简便，不需要特别的仪器设备。其缺点是液体的表面张力无法支撑质量和体积较大的细胞悬液，因此细胞悬滴液体的体积一般局限在50 μL以内，从而细胞数量受限。同时这种培养方法在后续的药物处理及形态观察上操作繁琐，容易失误，难以用于大规模培养。

1.3 RCCS

RCCS主要由同轴旋转的氧化器和细胞培养容器组成[9]。系统旋转时，细胞培养容器内部充满培养基，且这些培养基可以紧紧围着水平轴进行转动。在旋转过程中，培养基均以相同的角速度转动，培养系统内的细胞在重力、离心力及科氏力的共同作用下呈现悬浮状态，进而聚集形成了类组织3D聚合物。在RCCS培养系统内的细胞不仅受到的机械外力较小，还能够得到充足的营养以及氧气等必备物质，可有效促进各种细胞的增殖和诱导分化[10]，利于细胞信号的传导[11]。同时RCCS无须推进器和搅拌器辅助，剪切力极低，对细胞伤害小，特别适合神经细胞的生长。旋转式发酵罐容积可以做的较大，适合于大规模的细胞培养[12]。CUI等[13]利用胶原海绵材料建立微重力环境的RCCS培养神经干细胞(NSCs)，通过免疫荧光染色检测神经分化标记物，发现RCCS系统中胶原海绵培养的NSCs具有良好的神经元分化和迁移能力，有助于NSCs的培养和分化。

1.4 磁性纳米粒子培养法

该方法主要采用噬菌体、氧化铁磁性粒子及金纳米复合颗粒。噬菌体感染细胞后，磁性纳米颗粒转运到细胞内，在外部磁场的作用下，包含磁性粒子的细胞产生磁性，同时通过对磁场的空间控制，调控细胞群的几何形状[14]。沈亦雯等[15]通过快速聚集无血清悬浮培养法诱导胚胎干细胞转化为皮质前体细胞和皮质椎体神经元细胞，发现胚胎干细胞无须外部诱因即可自主转化为状态良好的神经细胞，且诱导率极高，为神经系统退行性疾病及神经组织修复带来希望。

2 支架培养法

支架系统主要是将细胞接种或分散于疏松多孔的细胞支撑结构支架中，而形成3D形态的细胞结构。理想支架材料应具备以下特点：无毒且具有良好的生物组织相容性；具有一定孔隙率和良好的表面活性；具有生物可降解性、可塑性和适当的机械强度；能促进细胞间黏附和增殖。根据支架材料及制备方式的不同，分为水凝胶支架、脱细胞支架、静电纺丝支架，除此之外可制备结构支架的微流控芯片技术、3D生物打印技术等也广泛应用于神经细胞的3D培养。

2.1 水凝胶支架

水凝胶由亲水聚合物链在富水环境中形成，因其具有良好的生物相容性和3D网络结构，近年来越来越多地应用于3D细胞的培养[16-17]。

水凝胶的应用较早，分类方法较多，根据材料种类或来源不同可分为天然水凝胶和合成水凝胶。用于神经细胞培养的天然水凝胶材料通常由海藻酸钠、胶原、氨基酸和多肽类凝胶因子在体外凝集而成。这类支架材料含水量较高、孔隙较大[18]，为细胞的支撑和细胞间的物质交换提供了良好的环境。CHEN等[19]建立了3D多孔胶原支架用于神经元肿瘤干细胞(NCSCs)的培养，神经元核免疫染色检测显示，80 μm多孔胶原支架可以增强NCSCs的附着、分化能力和细胞活力，为神经组织工程和神经再生提供了新的研究手段。

合成水凝胶是利用化学材料人工合成3D结构的高分子，常用材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇等。目前，人工合成的水凝胶已经商品化，使用较广泛的是商品名为Matrigel的凝胶，其可通过改变合成材料的分子量大小和交联密度来调节孔径大小及生物降解率等，适合用于多种神经细胞的3D培养[20-21]。LI等[22]制作了D-甘露醇晶体与甲基丙烯酰胺壳聚糖(MAC)混合凝胶支架，研究神经干/祖细胞(NSPCs)于不同孔隙率下的分化机制。结果表明随着孔隙率的增大和培养时间的延长，NSPCs分化速率明显增高，分化产生的颗粒细胞和球周细胞数量增加，且较大孔径的MAC水凝胶可有效地促进NSPCs的3D分化。

2.2 脱细胞支架

脱细胞支架是采用化学和物理方法去除组织中的细胞，形成无免疫原性或低免疫原性的材料，用于构建神经细胞培养的支架[23-24]。按照制备方式不同分为物理法和化学法。常用的物理方法包括高渗盐法、低渗联合冻干法以及反复冻融法，化学法主要采用Triton X-100、Sulfobetaine-10(SB-10)、Sulfobetaine-16(SB-16)等针对神经进行脱细胞处理。侯博等[25]通过处理大鼠坐骨神经制作成脱细胞支架，采用Triton X-200、SB-10、SB-16联合脱氧胆酸钠及过氧乙酸处理神经组织，去除细胞核及可导致免疫原性的神经纤维髓鞘成分。结果显示支架呈现不规则多孔状结构，同时基底膜管壁结构清晰且保留完整，该方法制备出的支架可最大限度保护ECM，具有低免疫原性，可有效促进神经细胞再生。

2.3 静电纺丝支架

静电纺丝是高分子流体静电雾化的一种形式，在静电的作用下雾化分裂出的物质不是液滴而是微小射流，然后固化成纤维。通过特定方法可以得到3D结构的纳米纤维支架，通过相关参数可调控支架的孔隙度、纤维尺寸和形态等。静电纺丝支架模仿了ECM结构，可为神经细胞的生长提供适宜生长环境，在对支架表面修饰后，可通过控制生物化学信号来调控细胞黏附、迁移以及增殖等一系列生物学行为[26-27]。MUTHUSAMY等[28]通过静电纺丝制作生物合成材料作为细胞支架，进行小脑颗粒细胞的培养，结果显示，与对照组比较，此种支架培养方法明显促进了神经轴突的生长。

2.4 微流控芯片技术

微流控芯片技术是一种将细胞、组织、化学试剂等样品从制备、反应到分离检测等多种操作方式高度集中在芯片上的技术，通过设计网格状微通道，以流体控制整个系统。该技术能将实验微缩到一个几平方厘米的芯片上进行，因其具有精准性、便捷性优势，目前广泛应用于细胞培养、疾病诊断、病例研究及药物筛选等[29]。目前用于细胞培养的微流控芯片主要以聚二甲基硅氧烷为原料，在其表面雕刻出培养细胞的微通道，再用胶原溶液或者多聚赖氨酸溶液亲水处理后接种细胞[30-31]。微流控芯片技术允许在微米、纳米级的通道中对流体进行空间控制，以空间可控的方式共培养多种细胞，可动态梯度灌注培养，并能实现单个细胞的精确操作。微流控芯片可实现NSCs的定向分化，如KIM等[32]研究该技术对NSCs的定向分化能力，结果表明该方法可促进NSCs朝着星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化，抑制向神经元方向分化，为神经递质代谢、突触信号传递等过程的研究提供了可能。

2.5 3D生物打印技术

3D生物打印技术可以直接将细胞、蛋白及其他具有生物活性的材料(例如蛋白质、DNA、生长因子等)作为3D打印的基本单元，以3D打印的方式，直接构建体外生物结构体、组织或器官模型。

现阶段，3D生物打印技术的仿生对象通常为ECM[33-34]。ECM中富含胶原蛋白、蛋白多糖和糖蛋白，这些蛋白在提供支撑作用的同时，还可结合生长因子，参与细胞信号传导等过程。3D生物打印技术可制备完整的ECM支架，用于ECM组成、空间分布和生物学功能的分析[35]。利用3D生物打印技术精准调控功能性材料的呈现，可实现特异性ECM的体外复制。生物打印仿生还可通过打印细胞或细胞聚集体，产生并沉积ECM，自发地构建出适合细胞自身生长的微环境，进而促进自身功能的发挥。SHABANI等[36]研究ECM成分的结构和功能，发现不同ECM混合材料对于NSCs神经再生、存活、迁移以及分化等多种生物学功能均具有调控作用。LEE等[37]以胶原前体为细胞支架，通过3D生物打印技术将大鼠胚胎神经元和星形胶质细胞打印在支架表面，以碳酸氢钠溶液为雾化气溶胶使胶原蛋白凝胶化，构建单层或多层3D细胞-水凝胶复合材料，结果表明，大鼠胚胎神经元和星形胶质细胞生长能力增强，且数量成比例增加。

3 神经细胞3D模型应用

神经细胞3D模型可用于神经细胞培养、神经系统疾病发病机制以及治疗方案的研究和药物研发、筛选等多个方面。

3.1 神经系统疾病研究

常见的神经系统疾病有帕金森综合征、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症等，这些疾病给患者及家属带来巨大痛苦和经济负担，故而近年来关于其发病机制、治疗方案以及药物开发等的研究发展迅速[38-40]。通过体外3D培养技术可对神经细胞的发育状态、形态及其与周围环境的关系等方面进行详细观察。

CHEN等[41]采用熔融静电纺丝法制备了高度有序的3D支架并对支架表面进行修饰，研究不同表面修饰等离子体处理后的双聚D-赖氨酸涂层和粘连蛋白涂层对PC12细胞(成年大白鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的细胞系)生长的影响。结果表明经等离子体处理后的双聚D-赖氨酸涂层和粘连蛋白涂层修饰的支架最有效，可显著促进PC12细胞生长，为神经损伤修复提供了一个多功能培养平台。

WANG等[42]利用脱ECM水凝胶和甲基丙烯酸明胶组成的混合水凝胶体系进行3D神经细胞培养和细胞负载生物打印，这种水凝胶技术可重现组织的功能性，避免了生物打印中挤压方式对组织的破坏，在再生医学领域具有巨大的应用潜力。MA等[43]制备了聚乙烯醇和海藻酸钠复合水凝胶，在复合水凝胶中随着聚乙烯醇比例的增高，水凝胶的孔径和溶胀率增大，弹性模量减小。此外，与海藻酸钠水凝胶相比，复合水凝胶与小鼠神经祖细胞(NPCs)还有良好生物相容性，提高了NPCs增殖能力，为构建神经组织工程和神经疾病模型提供了合适支架。

3.2 药物筛选

一般利用体外实验进行候选药物的安全性研究，体外实验可以检测给药后靶细胞的受损程度、毒副作用、安全性等。药物的作用价值直接在靶细胞的损伤程度上体现出来，在检测过程中，安全性实验可以体现候选药物的毒副作用和其他不良反应。在3D培养系统中培养神经细胞，可观察细胞形态、发育潜力及其与毗邻组织的功能整合性，故而3D细胞培养技术可应用于药物的筛选，且效率和安全性更高，结果更准确[44-45]。

CHANG等[46]以3D类器官技术诱导人类多能干细胞(IPSCs)向神经元细胞分化，用于大规模神经系统疾病的药物筛选和检测。对阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、脊髓小脑萎缩等药物的研发提供依据。GARCIA-LEON等[44]应用人IPSCs产生神经细胞为阿尔茨海默病药物筛选提供相关平台。

4 展望

神经细胞的3D培养技术正处于快速发展的阶段。神经细胞3D培养技术为阐明神经疾病的发病过程、机制以及特异性药物的研发提供了基础。但其仍存在一些缺陷：由于3D培养技术操作复杂，支架材料成本高，不能满足大规模的实验要求。此外，除了微流控芯片技术及3D生物打印技术，大部分3D培养技术无法模拟血管结构，极大限制了神经细胞的生长发育。因此，这些体外培养技术主要应用于神经疾病的早期表现、药物活性筛选和机制研究，晚期病变及药物研究大多仍需要动物实验支持。相信不久的将来，神经细胞3D培养技术会更加完善，这有利于进一步替代传统的动物体内实验，同时也有利于更深入揭示人类神经损伤和神经疾病的发病机制和过程，为神经药物的研发奠定基础。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者贡献：关冀弛、陈艳阁、樊雪参与了研究设计；关冀弛、汪海峰、刘丹参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions：The study was designed byGUANJichi,CHENYange, andFANXue.The manuscript was drafted and revised byGUANJichi,WANGHaifeng, andLIUDan.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.