内质网蛋白TMEM166对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激的影响及其机制

蒲明怡 王喆 廖肇忠 巩遵双 杨伟燕 华君男 李宁

(1 青岛大学基础医学院，山东 青岛 266071; 2 青岛市胶州市妇幼保健计划生育服务中心)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是全球常见的人类第二大神经退行性疾病，目前仍没有有效的治愈手段，只能通过药物延缓其进程[1]。人口老龄化加剧、治疗手段缺乏、靶向用药困难等因素，使得这类老年慢性疾病的治疗情况更加严峻[2]。因此，深入揭示PD的发病机制，寻找有效的治疗靶点将为PD的治疗提供新的策略。

内质网跨膜蛋白166(TMEM166),亦称Eva-1同源蛋白A，最初是2007年在人肾脏cDNA文库中鉴定出的一个与凋亡和自噬有关的内质网跨膜蛋白[3]。对TMEM166-/-和野生型小鼠脑的定量蛋白质组学分析发现，有11种蛋白质表达上调，17种蛋白质表达下调，这些蛋白质与ATP合成、氧化磷酸化和三羧酸循环有关[4]。并且通过基因富集分析进一步发现，这些失调的蛋白与一些神经退行性疾病，如阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病(HD)以及PD等密切相关[5]，但是TMEM166在神经退行性疾病发病中的具体作用尚未见研究报道。

线粒体功能障碍引起的神经元氧化应激在PD的发展中起着至关重要的作用，MPP+处理的SH-SY5Y细胞是高度模拟神经细胞线粒体功能障碍导致氧化应激的PD细胞模型[6-7]。本研究尝试初步探索TMEM166对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激的影响和机制，以进一步探讨自噬与PD的相关性，为PD的治疗提供新的靶点和策略。

1 材料与方法

1.1 细胞和质粒

人神经母瘤细胞系SH-SY5Y由我院生物化学与分子生物学实验室提供。Myc-TMEM166过表达质粒和Myc空质粒由浙江大学刘伟教授馈赠。

1.2 试剂

CCK-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，活性氧(ROS)检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，1-甲基-4-苯基-吡啶碘化物(德国默克公司)，3-甲基腺嘌呤(3-MA)(美国MCE公司)，兔抗人TMEM166多克隆抗体(英国Abcam公司)，兔抗人p62多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，鼠抗人LC3单克隆抗体(北京博尔迈生物技术有限公司)，荧光定量PCR试剂盒ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix、RNA逆转录试剂盒HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。

1.3 细胞培养

将SH-SY5Y细胞培养于含体积分数0.01青霉素/链霉素溶液和体积分数0.10胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2无菌恒温培养箱内培养至对数生长期且适宜密度时用于后续实验。

1.4 研究方法

1.4.1细胞相对活力检测 接种SH-SY5Y细胞至96孔板中，待细胞贴壁后，按照高糖DMEM培养基中加入的MPP+浓度不同分为A组(0 mmol/L)、B组(1.0 mmol/L)、C组(1.5 mmol/L)，每组设5个复孔，每组细胞培养24、48、72 h时吸出原培养基，每孔分别再加入110 μL含有10 μL CCK8的高糖DMEM培养基，混匀，置于培养箱中继续孵育2 h，采用酶标仪测定波长450 nm处的吸光值。

1.4.2细胞中ROS含量检测 接种SH-SY5Y细胞至6孔板中，待细胞贴壁后，按照A、B组处理方式于高糖DMEM培养基中加入MPP+，培养24 h后吸出原培养基，用无血清基础培养基洗涤2次，每孔加入1 mL DCFH-DA(10 μmol)探针，在细胞培养箱孵育30 min后，弃探针，无血清培养基清洗细胞3次，加入1 mL无血清培养基或PBS，荧光显微镜下观察并拍照，实验重复3次，实验结果取均值。

1.4.3蛋白质印迹(Western blot)实验检测细胞中TMEM166及自噬相关蛋白质的表达水平 取生长状态良好的SH-SY5Y细胞，以每孔2×105个接种于6孔板中。待细胞密度达到80%时，按照A～C组处理方式于高糖DMEM培养基中加入MPP+，培养24 h后，提取总蛋白。配制浓度为12%及5%的SDS-PAGE分离胶以及浓缩胶，等质量上样，先80 V后110 V恒压电泳，300 mA恒流湿转法转膜。转膜完成后，取出PVDF膜放入50 g/L BSA的TBST溶液中室温封闭2 h，取出膜于一抗中孵育，4 ℃冰箱过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，接着室温下于二抗中孵育1 h，TBST洗膜3次，在避光条件下于ECL显影液中孵育，上机曝光，并使用Image J软件分析目的条带TMEM166、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ和内参蛋白β-actin条带的灰度值，以目的条带与内参条带灰度值比值表示相关蛋白的表达水平。

1.4.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应检测细胞中TMEM166 mRNA水平 采用TRIZOL法分别提取A～C组SH-SY5Y细胞培养24 h后细胞中总RNA，测定RNA纯度与浓度，引物名称及序列见表1。以GAPDH为内参照，逆转录为cDNA并进行RT-qPCR。每个样品分别设5个复孔，实验重复3次，使用2-△△CT公式计算目的基因的相对表达水平。

表1 引物名称及其序列

1.4.5细胞转染及3-MA处理 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以每孔约2×105个细胞的密度接种于6孔板中，待细胞密度达到80%时，使用lipofectamine 2000按照说明书的用量分别转染Myc-TMEM166质粒(D组)和Myc载体空质粒(E组)，6 h后加入1.0 mmol/L MPP+处理，24 h后裂解细胞提取蛋白，按照1.4.3的方法检测p62、LC3Ⅱ/Ⅰ和内参蛋白β-actin的表达水平。将SH-SY5Y细胞分为D、F 2组，D组按照上述的方法转染Myc-TMEM166质粒，6 h后加入1.0 mmol/L 的MPP+处理24 h，F组转染Myc-TMEM166质粒，6 h后加入1.0 mmol/L的MPP+和1.0 mmol/L的3-MA共同处理24 h，然后按照1.4.2 的方法检测细胞中ROS的含量。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组SH-SY5Y细胞的细胞相对活力及ROS含量比较

析因设计方差分析结果显示，时间、组别及交互作用均对细胞相对活力有明显影响(F组别=32.85，F时间=93.36，F时间*组别=7.60，P<0.05)。单独效应结果显示，B、C组细胞在不同时间的细胞相对活力比较有显著差异(F=58.56、35.81，P<0.05)，在同一时间点，各组细胞的细胞相对活力比较也有显著差异(F=21.56～45.16，P<0.05)，见表2。MPP+处理24 h后，A、B组细胞的ROS荧光强度分别为2.548±0.169、8.772±0.379，两者比较有显著差异(t=25.94，P<0.05)。

表2 不同时间各组SH-SY5Y细胞相对活力比较

2.2 各组SH-SY5Y细胞中TMEM166蛋白表达水平比较

A～C组SH-SY5Y细胞中TMEM166蛋白的相对表达水平分别为1.004±0.012、0.875±0.035、0.442±0.036，组间比较差异有显著性(F=290.80，P<0.05)，其中各组间比较差异均具有显著性(t=5.29～23.02，P<0.05)。A～C组SH-SY5Y细胞中TMEM166 mRNA的表达水平分别为1.005±0.049、2.301±0.108、3.330±0.157，组间比较差异有显著性(F=315.20，P<0.05)，其中各组间比较差异均有显著性(t=11.08～25.05，P<0.05)。

2.3 TMEM166过表达对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的相对活力和ROS含量的影响

D、E组SH-SY5Y细胞TMEM166蛋白表达水平分别为1.944±0.040、0.431±0.017，两组比较差异有显著性(t=3.96，P<0.05)；D、E组细胞相对活力分别为0.627±0.023、1.003±0.016，两组比较差异具有显著性(t=4.77，P<0.001)；D、E组细胞的ROS荧光强度分别为22.310±1.528、12.320±2.084，两组比较差异有显著性(t=6.69，P<0.05)。

2.4 过表达TMEM166对细胞自噬相关蛋白表达水平的影响

D组细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白的表达水平分别为0.772±0.049、0.634±0.071，E组分别为0.137±0.021、1.093±0.033，两组上述两种蛋白蛋白表达水平比较差异均具有显著性(t=2.91、3.99，P<0.05)。

2.5 药物抑制TMEM166导致的自噬对SH-SY5Y细胞中ROS含量的影响

D、F组细胞ROS荧光强度分别为19.580±1.824、13.280±2.106，两组比较差异有显著性(t=3.91，P<0.05)。

3 讨 论

PD是第二大神经退行性疾病，目前没有有效治愈方法，其治疗耗费巨大，给患者家庭带来沉重负担。近年来对PD的深入研究发现，细胞自噬与PD的发生及发展密切相关[5,8]，例如细胞自噬广泛参与了PD致病蛋白α-突触核蛋白(α-syn)的降解[9]，SNCA、LRRK2和PINK1/Parkin等家族性PD相关突变基因的蛋白都参与到了自噬过程中[10-11]。一方面，在家族遗传性的PD患者群体中，中脑黑质多巴胺能神经元中的自噬普遍受到阻滞，不能有效清除细胞内的错误折叠蛋白而逐渐变性死亡；另一方面，基于这些PD相关基因(Parkin，PINK1等)构建的动物模型中，细胞内线粒体质量不能得到有效的控制，导致细胞能量平衡破坏，多巴胺能神经元之间不能进行高效的细胞信号交流，最终造成PD或其他中枢神经系统相关的疾病[12]。基于PD患者神经元细胞自噬受阻的这一特点，探索其中的自噬调节机制，或许是治疗该疾病的关键“钥匙”。靶向自噬治疗PD的理论已被提出并广泛研究，然而一些新发现的自噬调节蛋白与PD的联系还未知，探索这些自噬调节蛋白与PD的关系及其对PD靶向治疗的价值具有重要意义。

TMEM166是一种新发现的促进自噬的内质网跨膜蛋白，经前期研究发现，TMEM166与自噬相关蛋白16L(ATG16L)存在相互作用，促进ATG12-ATG5/ATG16L复合物在自噬体膜上的招募，进而促进自噬小泡的形成[13]。TMEM166在肿瘤中的作用也备受关注，TMEM166在众多的肿瘤组织中呈明显的低表达，且其外源性的过表达会减弱肿瘤细胞的“癌性”，表明TMEM166是一种抑癌基因[14-20]。值得注意的是，TMEM166-/-小鼠的蛋白质组学研究提示，TMEM166极有可能在PD等神经退行性疾病中发挥作用[4]。基于此，本研究借助MPP+诱导的SH-SY5Y PD细胞模型，初步研究了TMEM166在PD发生和发展中的作用。首先，本研究经过筛选采用1 mmol/L浓度的MPP+处理神经母瘤SH-SY5Y细胞系24 h，产生可辨别的ROS模拟氧化应激状态，并且细胞存活数量较多，适合后续实验。其次，本研究发现，在MPP+处理过程中，TMEM166的mRNA表达水平升高，而其蛋白水平降低，表明TMEM166蛋白在MPP+处理过程中被降解；外源过表达TMEM166再经MPP+处理，会促进MPP+诱导的ROS产生，表明TMEM166过表达加重了SH-SY5Y细胞的氧化应激，不利于细胞存活，这与TMEM166对肿瘤细胞有抑制作用的观点是一致的[14]，因此细胞会自主地选择将TMEM166降解。TMEM166在PD细胞模型中被降解以及其降解方式，之前还未见相关报道，鉴于已有研究的自噬相关跨膜蛋白LC3及GABARAP都是通过自噬途径被降解的，而一般的跨膜蛋白是通过溶酶体降解，并且有研究鉴定出TMEM166蛋白存在溶酶体定位[17]，因此推测TMEM166作为内质网跨膜蛋白，很可能通过自噬途径被降解，但还需要进一步研究证实。本研究对TMEM166促进氧化应激的机制进一步探索发现，过表达TMEM166会造成自噬衔接蛋白p62的表达水平降低，以及代表噬体膜含量的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平的升高，均提示TMEM166促进了SH-SY5Y细胞的自噬，这与先前发现TMEM166能够与ATG16L相互作用促进自噬小泡的形成，并正向调控自噬功能的研究结果相一致[13]。对SH-SY5Y细胞过表达TMEM166后，联合使用自噬抑制剂3-MA和MPP+处理细胞，结果显示药物抑制自噬可以减少MPP+诱导的ROS产生，提示TEMEM166促进的自噬是MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的氧化应激反应加重的原因之一。

在自噬参与的各种癌症中，自噬往往扮演着双重角色。一方面，自噬的减弱会增加异常功能蛋白质的聚集，蛋白质质量不能得到控制，导致细胞向癌变方向发展；另一方面，自噬的增强可以为肿瘤细胞的增殖提供能量和原料[21-22]。而在神经退行性疾病中，神经元中的自噬往往表现出受阻，导致α-syn、tau蛋白或亨廷顿致病蛋白的堆积，而目前已有通过靶向自噬治疗神经退行性疾病的研究报道[23-25]。

综上所述，本研究通过MPP+诱导SH-SY5Y PD细胞模型探究TMEM166对神经细胞氧化应激的影响和机制，发现TMEM166促进的自噬对神经细胞的生存是不利的，神经细胞会降解TMEM166以减弱MPP+的细胞毒性，TMEM166降解障碍可能是促进PD进展的潜在机制之一，这一新发现可以为PD的自噬靶向治疗提供指导。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者贡献：李宁、王喆、蒲明怡参与了研究设计；蒲明怡、王喆、廖肇忠、巩遵双、杨伟燕、华君男、李宁参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions：The study was designed byLINing,WANGZhe, andPUMingyi.The manuscript was drafted and revised byPUMingyi,WANGZhe,LIAOZhaozhong,GONGZunshuang,YANGWeiyan,HUAJunnan, andLINing.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.