胶红酵母胞外多糖抗氧化活性及对药物性肝损伤的护肝机制

李梅林 马文锦 王 博 周彦兵 张永显 于长青 彭 涛

(甘肃省轻工研究院有限责任公司，甘肃 兰州 730000)

药物性肝损伤(Drug-induced liver injury，DILI)是指在应用治疗剂量的药物时，由于药物或其代谢产物引起的肝细胞毒性损伤，或肝脏对药物及代谢产物的过敏反应所致的疾病[1]。DILI约占所有药物不良反应的3.0%～9.0%，占肝炎患者的10%，随着临床药物种类的不断增加，DILI的发病率也随之增多。DILI目前尚无特效疗法，关键是早发现、早停药，并特异性地给予保肝解毒药物，其治疗基本原则是停止用药、查明原因、对症支持治疗[2]。因此，重视和加强DILI的发生与防治尤为重要。

胶红酵母(R.mucilaginosa)是酵母种属的一种，为单细胞真核生物[3-4]。课题组前期通过形态学、碳源/氮源同化试验及18S rDNA生物学方法，鉴定菌株CM-1为胶红酵母菌(R.mucilaginosa)。从R.mucilaginosaCM-1无机培养基中分离得到水溶性胞外多糖RmEPS，其产量为7.35 g/L，多糖RmEPS经纤维素交换柱、凝胶渗透等纯化方法可得到单一组分多糖RmEPS-11。文章拟通过研究胶红酵母胞外多糖对小鼠药物引起肝损伤的保护作用，分析其潜在的分子机制，为胶红酵母胞外多糖在功能性食品与药品中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

昆明小鼠：体重16～24 g，雄性，动物许可证号SCXK(京)2016-0006，北京维通利华实验动物技术有限公司；

胶红酵母(RhodotorulamucilaginosaCM-1)菌株：陕西科技大学食品与生物工程学院微生物研究室；

抗坏血酸：分析纯，河北鸿韬生物工程有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析纯，北京百奥莱博科技有限公司；

2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：分析纯，湖南韵邦生物医药有限公司；

偶氮二异丁脒盐酸盐(AAPH)：分析纯，上海基星生物科技有限公司；

异烟肼(INH)：生物试剂，西安利君制药有限责任公司；

利福平(RIF)：生物试剂，钟祥市耀威生物科技有限公司；

水飞蓟素(Silymarin)：生物试剂，上海西宝生物科技股份有限公司；

超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒：上海朝瑞生物科技有限公司；

2,4-二硝基苯肼：分析纯，成都联禾化工医药有限责任公司。

1.1.2 仪器与设备

酶标分析仪：HBS-1096A型，南京德铁实验设备有限公司；

高速冷冻离心机：CT15RT型，上海天美生化仪器设备有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-4型，金坛市宏华仪器厂；

实时荧光定量PCR仪：M381409型，北京中西远大科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 抗氧化活性 根据课题组[5]前期研究测定DPPH自由基、ABTS自由基和氧自由基清除能力，以及还原力。

1.2.2 对异烟肼和利福平肝毒性的保护作用 将雌雄小鼠随机分为4组，雌雄各半，每组8只。小鼠饲养1周后，采用相同给药方式，每天给药1次，持续给药7 d，其他饲养条件正常，最后1 d给药后，禁食禁水12 h后进行采样处理。试验组：① 空白对照组：注射0.9% NaCl溶液(20 mL/kg 的0.9% NaCl注射液)；② INH模型对照组：灌胃给药INH(以0.74 mmol/kg按0.2 mL/10 g体重)；③ RmEPS-11模型处理组：在INH模型组基础上，注射RmEPS-11溶液(按100 mg/kg进行肝保护)和300 mg/kg RIF；④ 水飞蓟素组：100 mg/kg 水飞蓟素和300 mg/kg RIF体重灌胃。

1.2.3 脏器指数测定及样品处理

(1)血样处理和脏器指数测定：根据文献[6-9]并修改。每只小鼠称重后，摘取眼球取血，将血样保存用于后期生物理化指标测定，包括丙氨酸转氨酶(ALT/GPT)、天冬氨酸转氨酶(AST/GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、蛋白质总浓度(T-Protein)，丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等。脱臼处死小鼠，剖腹取出肝和肾，观察其颜色及大小变化程度，称重。取肝脏右叶部分组织，一部分冻存用于测定生物指标，一部分样品用锡箔纸包好放入无RNAase的EP管中，液氮速冻后转入-80 ℃冰箱用于后期分子学试验；另一部分用10%福尔马林固定后，用于后续光镜下检验其病理学变化。

(2)肝匀浆制备：将保存的部分肝脏用生理盐水清洗，精确称重，剪碎，与生理盐水混匀制备肝匀浆组织[10]，离心，上清液于4 ℃保存。

(3)ALT/GPT的测定：按照试剂盒要求测定。

(4)AST/GOT的测定：按照试剂盒要求测定。

1.2.4 T-Protein测定 按照试剂盒要求测定。

1.2.5 SOD测定 按照试剂盒要求测定。

1.2.6 MDA测定 按照试剂盒要求测定。

1.2.7 GSH-PX测定 按照试剂盒要求测定。

1.2.8 病理学研究 经HE染色剂染色后[11]，光镜下观察肝组织的病理学变化。正常：肝组织结构相对正常，无变性等；1级：小叶结构正常，肝细胞略有脂肪变性，伴有轻度坏死；2级：变性程度加重，肝小叶可见明显坏死；3级(+++)：肝小叶结构不清，可见明显的大片状坏死病灶。

1.2.9 相关基因CYP2E1及表达 采用荧光实时定量PCR对其相关基因CYP2E进行定量表达。以GAPDH为内参基因，将-80 ℃冻存的小鼠肝脏在mRNA转录水平上进行CYP2E1和CYP1A2的差异研究。

1.2.10 总RNA的提取纯化 根据文献[12-15]并修改。

(1)破碎匀浆：将样品分别从-80 ℃冰箱中取出，加入液氮用研钵反复研磨成粉末状，并于冻融前研碎，转至加入RNAiso Plus的裂解液中，振荡混匀。将匀浆液转移至离心管中，室温静置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心5 min。

(2)提取：将氯仿加至匀浆裂解液中，振荡混匀，静置。4 ℃、12 000 r/min离心5 min，吸取上清液，加入等体积异丙醇，混匀，静置，4 ℃、12 000 r/min离心5 min。

(3)RNA沉淀的清洗和溶解：向沉淀中加入乙醇溶液，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，除去乙醇，添加一定量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。

(4)荧光实时定量PCR：按照试剂盒说明加样，在普通PCR的退火温度附近选择几个温度，用同一样品，得到Ct值最小的为最佳温度。

(5)统计学处理：采用SPSS 11.5统计软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性分析

2.1.1 DPPH自由基清除能力 由图1(a)可知，DPPH自由基清除活性随样品质量浓度的增加而增加。当样品质量浓度为8 mg/mL时，RmEPS-11和维生素C的清除率分别为66.15%，97.62%。RmEPS-11的IC50值为2.96 mg/mL。综上，RmEPS-11具有较高的DPPH自由基清除能力，提示RmEPS-11可以将电子或氢供给DPPH自由基。

2.1.2 ABTS自由基清除能力 由图1(b)可知，RmEPS-11对ABTS自由基的清除能力随样品质量浓度的增加而增加。当样品质量浓度为8 mg/mL时，RmEPS-11和维生素C的清除率分别为82.80%，99.57%，说明RmEPS-11表现出一定的ABTS自由基清除活性。

2.1.3 还原力 由图1(c)可知，当样品质量浓度为0～8 mg/mL 时，还原能力随样品浓度的增加而增大，当样品质量浓度为8 mg/mL时，还原力高达0.753。

2.1.4 氧自由基清除能力(ORAC值) 经计算，RmEPS-11的ORAC值为(560.38±6.45)μmol TE/g。由图1(d)可知，RmEPS-11具有强的氧自由基清除能力，主要因为多糖的氢原子贡献给了环上的C—H键或醛糖、糖醛酸上的O—H和其他位点来清除自由基。

图1 多糖RmEPS-11和抗坏血酸的抗氧化活性Figure 1 Free radical scavenging and reducing power activities of ascorbic acid and RmEPS-11

2.2 肝功能活性分析

由表1可知，通过异烟肼和利福平处理后AST和ALT含量显著提高(P<0.01)，表明其增大了肝脏的氧化应激。与空白对照组相比，模型组AST和ALT含量显著升高(P<0.01)。阳性对照组和RmEPS-11治疗组与INH模型对照组相比，AST、ALT含量显著降低(P<0.01)，因此AST、ALT可作为异烟肼和利福平肝毒性的评估指标。MDA、SOD和GSH含量也有类似变化。异烟肼和利福平处理后，试验鼠体内MDA含量升高，SOD和GSH含量降低(P<0.01)，与空白对照组相比，表明脂质过氧化，导致异烟肼和利福平中毒。阳性对照组和RmEPS-11治疗组与INH模型对照组相比，能降低MDA含量、调高SOD和GSH含量，最终接近模型组(P<0.01)，表明RmEPS-11在逆转肝损伤过程中起到一定作用。

表1 通过RmEPS-11治疗后血清中ALT、AST、SOD、MDA、GSH含量†Table 1 Effects of RmEPS-11 on serum ALT,AST levels and hepatic SOD activity,MDA and GSH content in rats

由图2可知，对照组的小鼠肝脏病理切片显示正常组织形态；用异烟肼和利福平处理的试验鼠呈现肝硬化、经典的组织凝固性坏死、大量纤维化、单核细胞浸润、出血、脂肪变性和再生结节的形成。RmEPS-11治疗组和阳性对照组中未发现组织病理学变化。综上，RmEPS-11能够治疗和改善异烟肼和利福平引起的肝损伤。

图2 小鼠肝组织的病理切片Figure 2 Histological examination of liver tissue sections stained with HE(×400)

2.3 CYP2E1的表达

由图3可知，CYP2E1在INH模型组中的表达量(1.90±0.42)与空白组(0.98±0.26)相比极显著升高(P<0.01)，但SC阳性对照组(0.75±0.19)和RmEPS-11治疗组(0.82±0.22)与INH模型组差异显著(P<0.05)，CYP2E1表达量明显降低。

异烟肼(INH)和利福平(RIF)是用于抗结核化疗的一线药物，具有潜在的肝毒性，可能导致药物引起的肝损伤，如果这种肝毒性不能及早识别，后果是致命的，且引起肝毒性的发病机制是多方面的[16-17]。一些研究[18-20]表明，CYP2E1参与INH和RIF肝毒性的形成过程，可能是细胞内过多自由基或毒性代谢产物堆积，造成氧化应激引起肝毒性，而抗氧化剂可以保护细胞和组织免受各种疾病中活性氧和其他自由基的有害影响。

1.空白对照组 2.模型组 3.阳性对照组 4.RmEPS-11治疗组图3 CYP2E1 mRNA的表达Figure 3 The CYP2E1 mRNA expression in all groups

3 结论

在多糖抗氧化活性的基础上评估了RmEPS-11对小鼠异烟肼和利福平引起的肝脏毒性的影响。结果显示，与异烟肼和利福平处理的小鼠相比，RmEPS-11给药后血清丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶水平和肝脏丙二醛含量显著降低，肝脏超氧化酶活性和谷胱甘肽过氧化物酶含量显著恢复。此外，肝脏的组织病理学损伤和凋亡肝细胞数量改善显著。机制研究表明，保护作用主要是由于CYP2E1mRNA表达水平的调节，导致有害自由基和ROS的形成减少，同时抗氧化能力提高，多糖RmEPS-11通过抑制肝CYP2E1抑制脂质过氧化，增加自由基的清除。在此基础上，后续应开展胶红酵母胞外多糖的急毒研究，研究半数致死量或最大耐受量，为其后期的开发利用提供安全依据。