蚕豆种子水分迁移路径上的微观结构变化

王雅博 王晓晓 李雪强 张西龙 张京京 诸 凯

(天津商业大学机械工程学院 天津市制冷技术重点实验室 天津 300134)

生物组织是一个复杂的有机体，包含细胞内液、细胞壁、细胞膜和细胞间隙等微观结构，其中90%的水均存在于细胞内。对于生物材料而言，水分运输方式包括水分自由扩散和水势梯度驱动下的水分迁移，相比于自由扩散，在水势梯度下的水分迁移更能反映植物组织内水分输运特性[1]。水分迁移会引起组织收缩出现质壁分离等宏观现象，也会发生细胞破裂进而形成孔隙等微观结构变化。如热风干燥产品细胞组织收缩、塌陷，真空冷冻干燥产品呈现多孔结构[2]。微观结构变化会导致宏观变化，也会通过影响质量传递的扩散进而影响脱水过程，所以研究干燥过程中微观结构的变化具有重要意义。

目前，大量研究集中于物料的水分迁移规律引起的微观结构变化。张群等[3]分析了蓝莓在干燥过程中水分迁移和内果皮微观结构的变化，结果表明，随着干燥过程中水分的散失，蓝莓果干发生皱缩现象，微观上为细胞壁微丝排列由紧密有序变得松散无序。卢映洁等[4]研究了带壳鲜花生在热风干燥过程中内部水分迁移情况以及花生仁和花生壳的微观结构，结果表明，花生在干燥过程中内部水分逐渐向外迁移，花生内部弱结合水含量不断减少且干燥会使花生壳与花生仁的结构变形。

由于生物组织具有一定的体积，在水势梯度驱动下，靠近组织表面的细胞水分最容易蒸发，而组织中心的水分需由中心向外扩散至表面蒸发。因此，脱水过程中，从组织中心至表面这一水分迁移路径中的不同位置的细胞呈现明显差异。此外，物料的结构、成分及干燥条件也会影响脱水过程中水分迁移路径[5]。廉苗苗等[6]对猕猴桃进行脱水实验后发现，猕猴桃中心和边缘部分的细胞大小差异显著，影响了水分在中心和边缘部分的迁移。H.C.P.Karunasena等[7]对新鲜的gala苹果细胞组织研究发现，干燥初始阶段食物材料表面水分主要从材料表面快速蒸发，内部水分倾向于向外表面扩散，并随着热气流蒸发。杨兴胜[8]构建了苹果组织内水分迁移微观模型并进行验证，根据微观模型分析苹果不同微观结构内的水分迁移规律，发现苹果组织表面失水速率比中心快100～1 000倍。刘显茜[9]建立了生物多孔材料干燥组织非稳态收缩递推模型，结果表明，物料组织收缩并非由外到内同步收缩，而是先失去水分的外部先收缩，失水多的外部收缩幅度大于失水少的内部，没有失水的部位不收缩。

目前，有关水分迁移路径上细胞微观结构变化规律的文献较少。本文将蚕豆种子的微观结构变化用尺寸参数和形状参数进行量化，可以看出不同位置的细胞大小以及形状变化，分析对比水分迁移路径上不同位置下的细胞直径、周长和面积与上表面组织边缘细胞的直径、周长和面积比值变化，进而得出蚕豆种子水分迁移路径上不同位置细胞的微观结构变化规律。对于理解潜在的细胞机制、蚕豆种子等生命材料的贮藏及后续建立干燥过程数学和物理模型提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为种植用蚕豆种子，购自天津。样品在(4±0.5)℃的温度下避光过夜。第二天进行脱水实验。实验前将蚕豆手工去皮，切成10 mm×10 mm×5 mm(长×宽×高)的长方体，质量为(0.41±0.01) g。

1.2 实验过程及样品制备

图1所示为蚕豆样品制备示意图。本文实验设备与文献[10]真空脱水实验设备相同。利用上述实验设备，在97 kPa真空度下进行两组脱水实验，温度分别为0 ℃和8 ℃，将上述处理的样品脱水0、30、90、120、180、240、270 min，且每个时间点的样品独立制备。然后将样品在液氮中冷冻至断裂获得用于显微镜检查的新切面。挑选具有相对平坦切面的样品，使用扫描电镜(SEM，SH-5000M，日本)分别观察研究脱水过程中的S、A、B、C、D、E处的微观结构的变化。扫描电镜下观察到的切片位置为切片纵切面由上至下平均分成5份后取得每一份中间位置面积相等的方形A、B、C、D、E及由上表面中心位置取得的与A、B、C、D、E面积相等的方形S。由图1可知，S、A、E位置处为组织边缘，其中S位置处为上表面组织边缘；B、C、D位置处为组织内部，其中C为样品中心、组织中心。扫描电镜下观察到的切片的呈现方式为面积相等的蚕豆细胞和组织二维图。

图1 切片样品制备

1.3 图像处理分析

在本实验中，采用1.2节的方法获取不同温度下各阶段S、A、B、C、D、E处的SEM图像，每个工况下可获得约 200 张显微图像。使用Image-Pro Plus6.0软件对获得的图像进行中值滤波、调整对比度与 γ 值、划分子区域、二值化与边界识别[7,10-11]，使用每个SEM图像中可用的刻度将其转换为实际尺寸。同样得到直径、周长、圆度和伸长率。对于每张给定组织样品的SEM图像，所有的子区域进行相同处理，得到所有数据后利用Excel进行数据处理，最后得到S、A、B、C、D、E处整体的具有代表性的平均细胞直径、周长、面积，圆度及伸长率。每种情况下(每个时间点)，可统计150～200个细胞。

2 参数确定

为了更好地了解水分迁移路径上不同位置细胞微观结构的变化规律，以t时刻S位置处的细胞平均值为基准，将细胞参数标准化。这种数据处理方法可以简化数值而且可以更加清晰地观察A、B、C、D、E位置处细胞与S位置处细胞的相对大小变化。

(1)

式中：D为t时刻下A、B、C、D、E相对应位置的细胞平均直径，μm；D0为t时刻下S处细胞平均直径，μm。

(2)

式中：P为t时刻下A、B、C、D，E相对应位置的细胞平均周长，μm；P0为t时刻下S处细胞平均周长，μm。

(3)

式中：A为t时刻下A、B、C、D，E相对应位置的细胞平均面积，μm2；A0为t时刻下S处细胞平均面积，μm2。

圆度：选择圆度(R)作为形态变化指标，表征细胞形状的变化。R=1代表圆形，且R越小说明偏离圆的程度越大[12-13]。圆度可按式(4)计算：

(4)

式中：AP为细胞面积，μm2；Pi为细胞周长，μm。

伸长率：

(5)

3 结果与分析

SEM扫描图像可以直观地研究不同位置下的蚕豆细胞结构的形态，0 ℃时在电子扫描显微镜 200倍成像情况下得到脱水60 min不同位置的蚕豆样品SEM图像，如图2所示。可知不同位置下的细胞形态大小差异显著。在所有样品中，S位置的细胞最小，D位置的细胞最大。C、D、E位置的细胞结构均匀，具有光滑的细胞壁且无明显的收缩迹象。而S位置处的细胞结构不均匀，观察到严重的折叠和收缩迹象。A、B位置观察到较小的折叠和收缩迹象。这主要是由于S位置处的细胞最容易失水且最先失水，组织内部的细胞不容易失水。

图3(a)所示为 0 ℃时不同位置的细胞相对直径变化。由图3(a)可知，新鲜样品(0 min)时，不同位置细胞直径相对变化量无规律性，说明新鲜样品各位置上细胞直径随机分布。与0 min时显著不同，随着脱水进行细胞直径相对变化量呈明显的规律性。120 min之前，细胞相对直径变化量随样品深度的增加先增加后减小。说明同时刻下细胞内部各处细胞直径高于边缘细胞，D位置处细胞具有最大直径。这是由于：样品边缘(S位置)的细胞最容易向外界环境失水并产生严重收缩，而内部(B、C、D位置)水分要跨越细胞和细胞间隙才能流至细胞表面实现蒸发。E位置直接与反应釜底面接触，影响了底面细胞水分的直接蒸发，导致D位置水分最不易流出。在120 min时，虽然仍呈现出中心细胞直径远大于边缘细胞的情况，但D位置细胞相对变化量与C位置接近。说明90～120 min时间内C位置处的细胞比D位置处的细胞经历了更大程度的失水及收缩。180 min的曲线相对平缓，但仍出现组织内部细胞相对直径变化量大于边缘细胞的情况。这种现象是由于样品内部的溶质分子随水分不断向表面迁移，积累在表面形成结晶，从而造成表面硬化。产品表面硬化产生以后，水分移动的毛细管断裂，水分移动受阻，导致边缘细胞水分变化不大。此时，由于细胞内部也逐渐趋于脱水平衡，内部细胞直径略大于边缘细胞直径。0～60 min，各个位置的相对直径变化量不断增加，说明内部细胞直径和上表面组织边缘细胞直径差距不断增大。60 min后，组织内部细胞直径和上表面组织边缘细胞直径差距逐渐缩小。这是因为0～60 min时上表面组织边缘大量失水，细胞收缩，上表面组织边缘细胞直径逐渐变小。组织内部刚开始失去自由水不发生收缩，内部细胞直径无显著变化。二者的相对直径变化量增加。60 min后，上表面组织边缘细胞已经失去大量结合水，水分含量较低，细胞直径不再发生剧烈变化。组织内部细胞失去结合水后收缩，内部细胞直径逐渐缩小，二者的相对直径变化量减小。

图3 0 ℃和8 ℃时不同位置下的细胞相对直径

图3(b)所示为8 ℃时不同位置的细胞相对直径变化。对比图3(a)和(b)可知，不同位置处的细胞直径变化量均呈先增加后减小的趋势，但8 ℃时同一时刻下各个位置的相对直径变化量小于0 ℃时的，此规律在最大相对直径变化量上体现的更显著。8 ℃脱水时，在C位置处呈现最大相对变化量。说明同一时刻，C位置处细胞的直径高于其他位置细胞，是因为温度对水分迁移有积极影响。在更高的温度下，水分子的运动增加导致更高的水分扩散率，内部水分向外扩散[14]。此时温度对于水分迁移的积极影响可以抵消E位置处直接接触的消极影响。与图3(a)不同的是图3(b)中显示90 min后细胞的相对直径变化量出现上升趋势。这是由于温度升高，细胞发生破裂融合的比例上升，使所测量细胞直径增加[10,15]。

图4所示为0 ℃和8 ℃温度下不同位置的细胞相对周长变化。图5所示为0 ℃和8 ℃时不同位置下的细胞相对面积变化。

图4 0 ℃和8 ℃时不同位置下的细胞相对周长

图5 0 ℃和8 ℃时不同位置下的细胞相对面积

脱水过程中相同温度下不同位置的细胞相对直径、相对周长、相对面积的变化趋势一致。由图可知，30～180 min边缘细胞和内部细胞的尺寸差距较大，180 min时尺寸差距显著减小。相对直径变化与相对周长变化的范围在-0.1～0.9之间，相对面积变化范围在-0.2～2.4之间。表明脱水过程中不同位置下的细胞相对面积的变化要远大于细胞相对直径与相对周长的变化。这可能是因为细胞面积的变化更能够体现出细胞体积的变化。因此本文专门针对绝对面积进行分析。

通过对比分析图3～图5可知，温度对不同位置的细胞尺寸参数的变化有影响。这是因为较高的温度可以增加空气和样品之间的热传递，并加速水的迁移[16]。0～30 min，温度越高，各个位置的尺寸参数变化越大。这种现象是因为温度能降低水分所受到的束缚力[17]，导致水分逐渐散失且内部水分逐渐向外迁移，促进细胞的收缩变形。相同温度下的细胞相对直径最大变化量、细胞相对周长最大变化量以及细胞相对面积最大变化量均在同一位置取得。0 ℃时最大相对变化量呈现在D位置处。8 ℃时最大相对变化量呈现在C位置处。

图6(a)所示为0 ℃时不同位置下的细胞面积。30～120 min时，同一时刻下随着样品位置距离的增加，细胞面积由S位置处的4 000～7 500 μm2升至D位置处的13 000～16 000 μm2然后降至E位置处的10 000～11 000 μm2。即细胞面积随厚度增加先增加后减小，在D位置处取得最大值。说明相同温度相同时刻下不同位置的细胞面积不同，组织边缘细胞的面积小于组织内部的，上组织边缘的细胞面积最小。因为组织边缘细胞先于组织中心细胞失水且发生收缩，收缩使得细胞壁发生折叠，细胞面积减小。E位置直接和反应釜底面接触减小了其表面扩散系数，导致底面细胞水分的蒸发减少致使D位置水分最不易流出，发生收缩程度小，面积比其他位置大。180 min时不同位置下的细胞面积集中在5 000～7 500 μm2之间，差异较小，说明完全脱水后，不同位置的细胞面积并未产生显著差异。这主要是因为脱水进行到后期组织边缘与组织内部的细胞结合水大量流出，细胞膜破裂，细胞结构发生塌陷使各个位置的细胞面积大小均匀，无明显差异。由图可知D位置的面积具有明显的增减变化。30～60 min，由15 000 μm2降至13 493 μm2；60～120 min，由13 493 μm2增至15 938 μm2最后到达16 126 μm2，这两个阶段主要与细胞膨压损失和细胞壁张力有关。第一个阶段随着脱水的进行，膨压趋于降低，细胞壁拉伸程度减小，整个细胞尺寸减小。大气对细胞有一个显著的正膨胀压力，使细胞形状保持椭圆形。然而。由于脱水的影响，细胞壁收缩，这有助于减小单个细胞的面积。第二个阶段细胞壁张力减小，并且经历较高程度的翘曲和起皱，以适应较低的细胞流体体积，细胞面积增加。

图6 0 ℃和8 ℃时不同位置下的细胞面积

图6(b)所示为8 ℃时不同位置下的细胞面积。对比图6(a)和(b)可知，180 min时二者细胞面积范围分别为5 000～7 000 μm2以及3 000～5 000 μm2。说明8 ℃下的面积变化大于0 ℃下的面积变化。即较高的温度会导致面积减少速率增大。这主要是由于膨压、细胞壁收缩和组织结构塌陷等快速变化。

图7所示为0 ℃和8 ℃温度下不同位置的细胞圆度。0 ℃时0～180 min，细胞圆度分布在0.85～0.95。8 ℃ 时0～120 min，细胞圆度分布在0.80～0.90。这与P. P. Lewicki等[13]认为植物细胞最常见圆度值为0.84和H. R. Bolin等[18]在Granny Smith苹果的显微结构表征中发现细胞的圆度值为0.82相符。这些数据表明植物细胞的形状接近于椭圆形。图7(a)中240 min时细胞圆度显著降低说明细胞偏离圆的程度较大，细胞形状变形较大可能由于膨压损失以及细胞间隙不规则性的快速增加。相关文献[19-20]曾报道细胞间隙会影响细胞形状的变化。中心细胞的圆度远大于其他位置，说明细胞变形是广泛的和不规则、不均匀的。孔隙的产生会使形状更加不规则，变形更明显。此阶段中心细胞的孔隙比其他位置的孔隙少，因此中心细胞变形较小。对比组织的圆度值可知，最后所得样品的圆度值略小于新鲜样品的圆度值，这与文献[21-22]报道的趋势相似。图7(b)中180 min时细胞圆度显著降低且中心细胞的圆度远大于其他位置，与图7(a)相比，细胞圆度在更短的时间内有更明显的下降。说明脱水温度会影响细胞圆度的变化趋势。温度越高，细胞圆度减少越明显，可能与温度加快水分迁移进程和细胞结构高度变形以及细胞骨架坍塌有关。

图8所示为0 ℃和8 ℃温度下不同位置的细胞伸长率变化。由图8(a)可知0 ℃时脱水过程中不同时刻的细胞最大伸长率在D位置处出现，说明此时主轴长大于次轴长。而8 ℃时无明显规律，但30 min时细胞的伸长率有显著的减小。对比图8(a)和(b)可知，0 ℃时细胞伸长率集中分布在1.2～1.8，8 ℃时细胞伸长率集中分布在1.2～1.9。8 ℃时曲线波动的幅度更大。即脱水温度会影响细胞的伸长率，温度较高时，曲线波动略大，文献[7]中也观察到相似的伸长率趋势。8 ℃时的细胞圆度与伸长率比0 ℃时的分布范围更广，说明8 ℃时细胞经历了更大的收缩。然而分析尺寸参数时0 ℃不同位置下的相对变量远大于8 ℃下的相对变量，可知8 ℃时脱水过程中细胞形状整体变化趋势更均匀一致。这是因为在较低的温度下，样品需要更多的时间从材料中去除水分，导致样品的整体变化比在高温下处理的样品更不均匀一致[23]。

图8 0 ℃和8 ℃时不同位置下的细胞伸长率

4 结论

本实验对蚕豆种子细胞进行数形分析，以研究水分迁移路上不同位置的细胞微观结构的变化规律，得到以下结论：

1)脱水过程中，与尺寸直接相关的细胞参数(相对直径、相对周长、相对面积以及面积)有显著的变化分布规律。细胞相对直径、相对周长以及相对面积的变化趋势一致，但相对面积变化更大。对面积而言，组织边缘细胞的面积小于组织内部的，上组织边缘细胞的面积最小。与细胞形状相关的参数(伸长率、圆度)随机分布在一个范围内，未观察到显著的规律性变化。0 ℃时，细胞圆度大体分布在0.85～0.95，细胞伸长率集中分布在1.2～1.8。8 ℃ 时，细胞圆度大体分布在0.80～0.90，细胞伸长率集中分布在1.2～1.9。

2)脱水温度会影响尺寸参数以及形状参数的变化。0～30 min，温度越高，各个位置的尺寸参数变化越大。0 ℃时最大尺寸参数变化量呈现在D位置处。8 ℃时最大尺寸参数变化量呈现在C位置处。与0 ℃相比，脱水过程中8 ℃时的细胞经历了更大的收缩，细胞形状整体变化趋势更均匀一致。