lncRNA SNHG11通过吸附miR-193a-5p 促进NSCLC 细胞A549 的恶性生物学行为

王羽，曹佳丽，陈哲聪，高梦源，陈文虎（杭州医学院.药学院；.临床医学院，.基础医学与法医学院 生物化学与分子生物学教研室，浙江 杭州 310059）

全球范围内，肺癌的发病率和病死率长期居恶性肿瘤首位。2018 年中国肺癌新发病例约82 万例、病死约71 万例[1]；其中以非小细胞肺癌（NSCLC）最为常见，占发病总数的80%以上[2]。据统计，经手术治疗后约40%NSCLC患者会因癌细胞转移或复发而死亡，且术后并发症会导致患者生存质量下降[3]。由于NSCLC 前期的临床症状并不明显，大多患者发现时已经是晚期，然而晚期患者的5 年生存率仅约15%[4]。因此，积极探讨NSCLC细胞增殖和转移的分子机制，对于防治具有十分重要的意义。研究结果[5-7]表明，lncRNA能够调控细胞增殖、分化和凋亡等生命活动，且与多种肿瘤的发生发展密切相关。lncRNA小核仁RNA宿主基因11（small nucleolus RNA host gene 11，SNHG11）被发现在人类的多种癌症中均表达异常[8-9]，但尚少见在NSCLC 中的报道。本研究探讨lncRNA SNHG11 对NSCLCA549 细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其是否通过靶向调控miR-193a-5p发挥作用，以期为NSCLC治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人NSCLC 细胞A549、NCI-H1299、HCC827 和人正常胚肺细胞HEL-1均购自ATCC，均用含10%FBS、1%青/链霉素的DMEM培养基在37 ℃、5%CO2、97%湿度的培养箱内培养，每1～2 d 更换1 次培养基。FBS、DMEM 培养基、胰蛋白酶均购自Gibco 公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒、一抗稀释液、超敏ECL化学发光剂均购自上海碧云天公司，小鼠抗人PCNA 单克隆抗体、兔抗人cyclin D1 多克隆抗体、兔抗人GAPDH 单克隆抗体均购自CST 公司，SNHG11、miR-193a-5p 的引物均购自北京擎科公司，转染试剂Lipo2000、TRIzol 试剂均购自Invitrogen 公司，Prime Script 逆转录试剂盒和TB Green PCR 实时荧光定量试剂盒均购自TaKaRa 公司，二甲基亚砜（DMSO）购自北京索莱宝公司，lncRNA SNHG11小干扰RNA（si-SNHG11）及其阴性对照（NC siRNA）、lncRNA SNHG11过表达载体及对照空白载体、miR-193a-5p模拟物（mimic）及阴性对照序列（NC mimic）、miR-193a-5p 抑制剂（miR-193a inhibitor）及抑制剂阴性对照序列（NC inhibitor）均购自上海吉玛公司，双荧素酶报告基因系统试剂盒购自美国Promega公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁生物公司。

1.2 qPCR 实验检测细胞中SNHG11 和miR-193a-5p的表达水平

使用TRIzol 试剂从细胞中提取总RNA，并使用Prime Script RT 试剂盒将RNA 逆向转录成cDNA。qPCR 采用TB Green PCR 试剂盒进行检测，U6 作为miR-193a-5p的内参，β-actin作为lncRNA SNHG11的内参。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

1.3 细胞转染与分组

将对数生长期的A549细胞调整为1×104个/mL，接种于6 孔板，当生长至60%汇合时，更换为不含FBS 的DMEM 培养基。根据转染试剂说明书将NC siRNA、si-SNHG11，NC mimic、miR-193a mimic，si-SNHG11 和NC inhibitor，si-SNHG11 和miR-193a inhibitor 分别转染至A549 细胞中，依次记为NC siRNA 组、si-SNHG11 组，NC mimic 组、miR-193a mimic 组，si-SNHG11+NC inhibitor 组和si-SNHG11+miR-193a inhibitor 组。qPCR 法验证沉默与过表达效果。

1.4 CCK-8 法检测SNHG11 与miR-193a-5p 表达变化对A549细胞增殖的影响

转染后的各 组 细胞调 整为1×104个/mL，按200µL/孔接种于96孔板，培养24、48和72 h后，每孔加入10 µL CCK-8 溶液，继续培养2 h，酶标仪测定450 nm处光密度（D）值。

1.5 WB 法检测SNHG11 与miR-193a-5p 表达变化对A549细胞中PCNA和cyclin D1表达的影响

转染后的各组细胞调整为1×106个/mL，接种于6 孔板，培养48 h 后胰蛋白酶消化，收集细胞，加入RIPA 细胞裂解液，冰上处理40 min，充分裂解后，4 ℃离心20 min，取蛋白上清液。BCA法测定蛋白含量，100 ℃煮沸5 min后冷却至室温，进行SDS-PAGE分离蛋白，再将蛋白条带电转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，分别加入抗PCNA（1∶1 000）、抗cyclin D1（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶5 000）一抗，4 ℃过夜，TBST 洗膜3 次，加入HRP 标记的二抗（1∶5 000），室温处理2 h，TBST洗膜3次，加入ECL化学发光试剂，避光显影后曝光、拍照。以GAPDH 为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.6 Transwell 实验检测SNHG11 与miR-193a-5p 表达变化对A549细胞侵袭的影响

人工基膜（matrigel）液化后用4 ℃的无血清培养基以1∶8 比例稀释，取50 µL 加入Transwell 小室上室，自然晾干；转染后的各组细胞用不含血清的DMEM 培养基调整至2×105个/mL，加入100µL 细胞悬液至上室，下室加入500µL含10%FBS的培养基。培养48 h后取出小室，弃培养基，棉签擦去基质胶和上层小室内侧细胞，用4%甲醛固定穿膜细胞30 min、0.4%结晶紫染色30 min，显微镜下观察，随机选取5个视野计数。

1.7 划痕愈合实验检测SNHG11 与miR-193a-5p 表达变化对A549细胞迁移的影响

用记号笔在6孔板背后均匀划4条直线，横穿过孔，调整各组细胞密度为1×104个/mL，接种于6孔板，当细胞生长至80%汇合时，弃培养基，用10µL 无菌移液器吸头尖端在各孔相同位置划线，PBS冲洗3次，去除划下的细胞，每孔加入无血清培养基培养24 h后镜下观察细胞迁移情况。

1.8 双荧光素酶报告基因实验验证SNHG11与miR-193a-5p间的靶向关系

生物信息学软件预测显示，SNHG11 与miR-193a-5p 的核苷酸序列存在结合位点。构建含SNHG11 野生型序列的重组载体（SNHG11 WT）与SNHG11 突变型载体（SNHG11 MUT）。分别将SNHG11 WT、SNHG11 MUT 与NC mimic 或miR-193a mimic共转染至A549细胞，6 h后更换新鲜培养基，继续培养48 h，收集细胞，裂解、离心、收集上清液，检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.9 统计学处理

采用SPSS19.0 软件进行数据处理和分析，符合正态分布的计量数据采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P<0.05或P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA SNHG11 和miR-193a-5p 在NSCLC 细胞中分别呈高、低表达

qPCR 检测结果（图1）表明，与HEL-1 细胞相比，在NSCLC 细胞中SNHG11 呈明显高表达（均P<0.05），其中A549细胞最为明显；而miR-193a-5p呈明显低表达（均P<0.05），其中A549 细胞最为明显。选择A549细胞进行后续实验。

2.2 沉默lncRNA SNHG11表达对NSCLCA549细胞增殖、侵袭和迁移的影响

qPCR 检 测结果（图2A）显示，si-SNHG11 组A549 细胞株中SNHG11 的表达显著低于NC siRNA组（P<0.05），说明转染si-SNHG11 成功沉默了A549细胞株中SNHG11 的表达。CCK-8 法检测结果（图2B）显示，si-SNHG11 组A549 细胞的增殖水平显著低于NC siRNA 组（P<0.05）；WB 法检测结果（图2C 和2D）显示，si-SNHG11 组A549 细胞中PCNA、cyclin D1 蛋白的表达水平显著低于NC siRNA 组（P<0.05）；划痕愈合实验（图2E）和Transwell实验（图2F）检测结果显示，si-SNHG11组A549细胞的迁移能力和侵袭细胞数均显著低于NC siRNA组（P<0.05）。

2.3 miR-193a-5p 过表达对NSCLCA549 细胞增殖、侵袭和迁移的影响

qPCR检测结果（图3A）显示，miR-193a mimic组A549细胞中miR-193a-5p的水平显著高于NC mimic组（P<0.01）。CCK-8法（图3B）、WB法（图3C）、划痕愈合实验（图3D）和Transwell 侵袭实验（图3E）检测结果显示，miR-193a mimic组A549细胞的增殖水平、PCNA和cyclin D1蛋白的表达、迁移能力与侵袭细胞数均显著低于NC mimic组（均P<0.05）。

2.4 lncRNA SNHG11靶向负调控miR-193a-5p表达

利用生物信息学数据库Starbase 3.0在线预测结果（图4A）显示，lncRNA SNHG11 的序列中含有与miR-193a-5p互补的核苷酸序列。双荧光素酶报告基因实验证实了两者的靶向关系（图4B）。qPCR 检测结果（图4C）显示，si-SNHG11 组A549 细胞中miR-193a-5p的表达水平显著高于NC siRNA组（P<0.01）。

2.5 抑制miR-193a-5p 表达逆转了沉默SNHG11 对A549细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用

将SNHG11 的干扰siRNA 和miR-193a-5p 的inhibitor 共转染至A549 后，CCK-8 和WB 实验的结果（图5A、B）表明，miR-193a inhibitor 逆转了沉默SNHG11 表达导致的细胞增殖能力的降低（P<0.05），也部分逆转了PCNA 和cyclin D1表达的降低（均P<0.05）。划痕愈合实验和Transwell实验结果（图5C、D）表明，miR-193a inhibitor 也逆转了干扰SNHG11表达引起的细胞迁移和侵袭能力的降低（均P<0.05）。

3 讨论

肺癌分为NSCLC和小细胞肺癌，其中NSCLC占85%。NSCLC 的发病受多基因调控，其发病机制并不明了[10]。研究[11-12]发现，许多lncRNA参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，在肿瘤中表现出异常的表达和调节活性，这些发现为指导疾病治疗和诊断提供新策略。

作为lncRNA 最主要的功能之一，其可以充当miRNA 海绵，与miRNA 目标位点竞争结合，以抑制miRNA 活性并参与miRNA 介导的转录后调控。例如，lncRNA PCAT6 在骨肉瘤组织中表达上调，通过靶向miR-139-3p 抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导骨肉瘤细胞凋亡[13]。lncRNA DANCR 通过调控miR-214-5p促进宫颈癌细胞的增殖及侵袭，提示其在宫颈癌中是一个具有促癌作用的分子，并有可能作为诊断和治疗的靶点[14]。lncRNA LINC00460 在NSCLC 患 者的癌组织中表达上调，且影响NSCLC 患者预后，是NSCLC 预后的独立预测因子[15]。前期研究结果[16]证实，lncRNA SNHG17 可通过调节miR-338-3p/SOX4 轴促进食管癌细胞的增殖和迁移。SNHG11 是一种新发现的lncRNA，可通过调节miR-184/AGO2促进肝癌细胞的增殖、迁移和凋亡[17]，通过调节miR339-3p/SHOX2 轴促进结直肠癌细胞进展[18]。因此，SNHG11被认为是潜在的促癌因子。本研究发现，SNHG11 在NSCLC 细胞中呈高表达。进一步探讨SNHG11 对NSCLC 细胞生物学功能的影响，结果显示，沉默SNHG11的表达可抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭、迁移，提示SNHG11 可能具有作为NSCLC治疗生物标志物的潜力。

miR-193a-5p对肿瘤细胞增殖和侵袭迁移具有重要作用，如miR-193a-5p 通过下调HOXA7 抑制人卵巢癌细胞的增殖[19]，通过影响SRSF6 介导的OGDHL和ECM1选择性剪接促进胰腺癌细胞转移[20]。此外，lncRNA TUG1 可通过海绵吸附miR-193a-5p 从而提高AML细胞的活力[21]。本研究证明，miR-193a-5p在NSCLC 细胞中呈低表达，而过表达miR-193a-5p 能够抑制A549 细胞的增殖、侵袭和迁移能力。生物信息学预测到SNHG11 与miR-193a-5p 存在结合位点，通过双荧光素酶报告基因实验证实了两者关系；沉默SNHG11 表达可上调NSCLC 细胞中miR-193a-5p的水平。而抑制miR-193a-5p 表达则能够逆转沉默SNHG11 表达对NSCLC 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

综上所述，本研究发现SNHG11在NSCLC细胞中呈高表达，沉默SNHG11可通过调节与其直接结合的miR-193a-5p发挥调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移的作用。SNHG11 可能成为NSCLC 治疗潜在新靶点。