长链非编码RNA SOX21-AS1调控miR-31-5p/MMP-16轴对胰腺癌细胞活性与增殖的影响

臧龙军，陈东杰，高文哲，黄珲，朱红伟，余枭

（中南大学湘雅三医院肝胆胰II外科，湖南长沙410013）

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，是全球第12位常见恶性肿瘤[1]，也是癌症死亡的第七大原因；在我国，2003—2013年居民癌症数据显示，胰腺癌发病率在所有恶性肿瘤中排第10位；其中胰腺导管腺癌的病死率在所有恶性肿瘤中位列第5位，5年相对生存率在常见恶性肿瘤中最差，仅为7.2%，且呈逐年恶化的趋势[2]。胰腺癌起病隐匿，早期诊断困难，发现后即处于局部进展期或远处转移期，可手术切除率低，超过80%患者会在手术切除后复发[3]，预后极差。而现阶段仍缺乏针对中晚期侵袭性胰腺癌的治疗手段，因此深入了解胰腺癌的分子病理学机制才能有助于开发高特异度、高效的靶向治疗药物[4]。非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是不进行编码蛋白质的功能性RNA，其中包括长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）、环状RNA（circular RNA，circRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）。lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，是肿瘤进展中重要的调节因子，参与了包括增殖、迁移、分化、凋亡等众多细胞事件。此外，它还参与各种细胞过程，并通过与miRNA、mRNA相互作用等多种机制参与恶性肿瘤的发生、发展进程[5-8]。有研究报道lncRNA在胰腺癌发生、发展中发挥重要作用[9]，lncRNA LINC00261的上调能明显抑制胰腺癌在体内及体外的细胞增殖和迁移[10]，lncRNA TP73-AS1通过miRNA-128-3p/GOLM1轴促进胰腺癌细胞生长和转移[11]。除此，对胰腺癌有影响的lncRNA还有BCAR4[12]、RP11-567G11.1[13]、CASC2[14]。

SOX21-AS1是近年来新发现的一种位于人类13号染色体上长3 230 bp的lncRNA，为SOX21的反义基因，它与众多恶性肿瘤关系密切，研究表明SOX21-AS1影响肺腺癌侵袭和迁移[15]及宫颈癌病程的进展[16]。但目前SOX21-AS1在胰腺癌中的作用暂不明确。本研究旨在探索SOX21-AS1在胰腺癌病程发生发展中的相关作用及机制，以期对提高临床的诊治及改善预后发挥作用。

1 材料与方法

1.1 细胞系、细胞培养、转染与分组

5种胰腺癌细胞系（PANC-1、CAPAN2、CFPAC-1、BXPC3、SW1990）和人胰管上皮细胞系HPDE由美国典型培养物保藏中心提供。所有细胞都在RPMI1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中培养，培养基中添加10%胎牛血清（FBS，Thermo Fisher Scientific），在37℃、5%CO2加湿环境中培养。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）进行瞬时转染。靶向SOX21-AS1的两种siRNA购自ABC（Abcam，Cambridge，MA，USA）；miR-31-5p模拟物和miR-31-5p抑制剂购自Genechem（中国上海）。

1.2 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）分析

通过TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从组织或细胞中提取总RNA。用PARIS试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分离细胞核和细胞质来源的RNA。使用SYBR PCR试剂盒（德泰生物，中国南京）对SOX21-AS1和MMP-16 mRNA进行定量。使用NCode miRNA qRT-PCR分析评估miR-31-5p的表达水平。以GAPDH的表达水平为对照对SOX21-AS1的表达水平做标准化。将miR-31-5p的表达标准化为对照U6。本研究所使用的引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 细胞转染

miR-31-5p模拟物，miR-31-5p抑制物及其阴性对照购自RiboBio（中国广州）。为了抑制SOX21-AS1的表达，在U6/GFP/Neo质粒（GenePharma，中国上海）中构建了针对SOX21-AS1的siRNA序列（si-SOX21-AS1#1和si-SOX21-AS1#2），以携带非靶向序列的质粒被用作对照。使用Lipofectamine 2000试剂进行转染。转染后48 h，使用含有0.5 mg/mL G418的培养基（美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich）选择稳定转染的细胞。本研究中使用的所有引物均来自Genechem（中国上海）。转染所使用的miRNA及siRNA序列见表2。

表2 miRNA与siRNA序列Table 2 ThemiRNAand siRNAsequences

1.4 双荧光素酶报告基因检测

使用pmirGLO荧光素酶表达载体（Promega，美国）构建报告质粒。通过从SOX21-AS1插入包含预测的miR-31-5p结合位点的片段，克隆了野生型SOX21-AS1（SOX21-AS1-WT）质粒。通过使miR-31-5p的种子区域结合位点发生突变，可以创建一个SOX21-AS1基因突变质粒（SOX21-AS1-MT）。将HEK293T细胞铺在6孔板中，并用含有SOX21-AS1-WT或SOX21-AS1-MT片段和miR-31-5p模拟物或阴性对照的荧光素酶报告载体共转染。通过从miR-31-5p插入包含预测的MMP-16结合位点的片段，克隆了野生型MMP-16质粒（MMP-16-WT）。通过使miR-31-5p的种子区域结合位点发生突变，可以创建一个MMP-16基因突变质粒（MMP-16-MT）。将HEK293T细胞铺在6孔板中，并用含有MMP-16-WT或MMP-16-MT片段和miR-31-5p模拟物或阴性对照的荧光素酶报告载体共转染。48 h后测定荧光素酶活性。

1.5 细胞活力测定

使用MTT法测定细胞增殖。将转染的PANC-1或SW1990细胞接种在96孔板中，并在不同时间点（接种后1、2、3、4、5 d）测量细胞增殖。简而言之，将MTT溶液（20μL，Sigma-Aldrich）添加到细胞中4 h，除去培养基，然后添加二甲基亚砜。使用Quant Universal Microplate分光光度计（BioTek，Winooski，VT，美国）测定490 nm处的吸光度。

1.6 集落形成试验

转染后将细胞添加到6孔板（500个细胞/孔）中。2周后，将细胞固定，染色，然后成像并使用光学显微镜计数。

1.7 统计学处理

实验数据以平均值±标准差（±s）表示，并使用Student'st检验和单向方差分析进行评估。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。所有检验均为双侧，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOX21-AS1在胰腺癌组织和细胞中的表达及对预后的影响

在使用qRT-PCR对20例胰腺癌患者的胰腺癌组织和匹配的邻近癌旁组织中的SOX21-AS1表达水平进行检测后，结果显示，SOX21-AS1在胰腺癌组织中表达明显高于癌旁组织（P＜0.01）（图1A）。此外，实验结果还显示，与癌旁组织HPDE相比，胰腺癌细胞系PANC-1、CAPAN2、CFPAC-1、BXPC3、SW1990中SOX21-AS1表达均升高（均P＜0.05），其中SOX21-AS1在BXPC3、SW1990细胞中的表达高于其他细胞株，因此选用胰腺癌BXPC3、SW1990细胞为研究对象进行后续敲低实验（图1B）。通过GEPIA数据库检索发现，SOX21-AS1高表达患者较其低表达患者预后差（P＜0.05）（图1C），表明SOX21-AS1可能与胰腺癌病程发展的恶性程度密切相关。

图1 胰腺癌中SOX21-AS1的表达及其对预后的影响A：qRT-PCR检测20对胰腺癌标本和邻近正常组织中SOX21-AS1的表达量；B：qRT-PCR检测不同胰腺癌细胞系与正常胰腺导管上皮细胞中SOX21-AS1表达量；C：TCGA生物学数据库分析SOX21-AS1表达对胰腺癌患者预后的影响Figure 1 Expression of SOX21-AS1 in pancreatic cancer and its association with the prognosis A:Relative expression of SOX21-AS1 detected by qRT-PCR in 20 cancer tissues and matched normal tissues;B:qRT-PCR analysis of the relative expression of SOX21-AS1 in pancreatic cell lines and normal pancreatic duct epithelial cell line;C:Influence of SOX21-AS1 on prognosisof pancreatic cancer patientsby TCGAanalysis

2.2 沉默SOX21-AS1表达对胰腺癌细胞活力及增殖的影响

由于SOX21-AS1在胰腺癌组织和细胞中表达上调且与胰腺癌病程发展的恶性程度呈正相关，进一步使用功能丧失实验来确定其是否影响胰腺癌细胞的细胞活力及增殖水平。在使用靶向SOX21-AS1的两种特定的siRNA转染BXPC3、SW1990细胞后，qRT-PCR的结果发现，与阴性对照组（si-NC）比较，BXPC3和SW1990细胞中，si-SOX21-AS1#1组与si-SOX21-AS1#2组中SOX21-AS1表达均降低（均P＜0.05）（图2A），表明转染后SOX21-AS1表达沉默，提示转染成功（且si-SOX21-AS1#1组中的沉默效果更明显，故在后续实验中使用该组siRNA进行沉默）。随后，通过MTT实验结果发现，BXPC3和SW1990细胞中si-SOX21-AS1#1组的细胞活力均较各自si-NC组明显降低（均P＜0.05）（图2B）。此外，克隆形成实验结果发现，在BXPC3和SW1990细胞中，si-SOX21-AS1#1组细胞增殖水平相较于si-NC组明显下降（均P＜0.05）（图2C）。这些数据表明，沉默SOX21-AS1的表达降低了胰腺癌细胞的细胞活力和增殖水平。

图2 SOX21-AS1对胰腺癌细胞活力、增殖的影响A：qRT-PCR检测SOX21-AS1沉默后胰腺癌BXPC3、SW1990细胞中SOX21-AS1表达量；B：MTT检测BXPC3与SW1990细胞的活力；C：细胞克隆实验检测BXPC3和SW1990细胞的增殖能力Figure 2 Effect of SOX21-AS1 on viability and proliferation of pancreatic cancer cells A:The relative expression of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells after SOX21-AS1 silencing detected by qRT-PCR;B:Cell viabilities of HPDE and BXPC3 cells determined by MTTassay;C:Thecolony formations BXPC3 and SW1990 cells measured by colony-forming assay

2.3 SOX21-AS1的靶miRNA预测及验证

研究[17]表明，细胞质lncRNA最常见的机制是作为竞争性内源RNA（ceRNA）来结合各种miRNA以抑制其对目标mRNA的调节作用。为了确定SOX21-AS1是否可以作为miRNA的ceRNA，首先用qRT-PCR检测了细胞核和细胞质中SOX21-AS1的表达，结果显示，SOX21-AS1转录本大多存在于细胞质中（图3A）。此外，通过DIANA数据库预测到SOX21-AS1与miR-31-5p存在靶向结合序列（图3B）。在BXPC3、SW1990细胞中，转染miR-31-5p模拟物后，miR-31-5p表达相比阴性对照组（miR-NC）明显升高（均P＜0.01）（图3C）。为了进一步证实SOX21-AS1与miR-31-5p存在相互作用，将野生型（SOX21-AS1-WT）和突变型（SOX21-AS1-MT）结合miR-31-5p模拟物检测荧光素酶活性，双萤光素酶报告结果显示，在共转染miR-31-5p模拟物后，SOX21-AS1-WT在BXPC3细胞中的相对荧光素酶活性明显降低，而SOX21-AS1-MT的活性没有明显改变，同样的，SOX21-AS1-WT在SW1990细胞中的相对荧光素酶活性也明显减弱，而SOX21-AS1-MT的荧光素酶活性没有明显改变（P＜0.01）（图3D），这不仅表明miR-31-5p是SOX21-AS1的直接靶标，也能证明miR-31-5p与SOX21-AS1结合位点存在于突变载体附近。qRT-PCR结果表明，在BXPC3和SW1990细胞中，沉默SOX21-AS1会导致miR-31-5p表达明显上调（P＜0.005）（图3E）；与正常人胰腺组织相比，人胰腺癌组织中miR-31-5p的表达明显降低（P＜0.01）（图3F）。为了进一步验证miR-31-5p与SOX21-AS1的关系，将SOX21-AS1与miR-31-5p行相关性分析，结果也发现，SOX21-AS1的表达与miR-31-5p呈负相关（r²=0.257 1，P＜0.05）（图3G）。

图3 SOX21-AS1与miR-31-5p的关系分析A：核质分离实验检测BXPC3与SW1990中SOX21-AS1的分布情况；B：DIANA预测SOX21-AS1与miR-31-5p中结合的靶向序列；C：qRT-PCR分析在BXPC3、SW1990细胞中过表达miR-31-5p后miR-31-5p的表达量；D：过表达miR-31-5p后，转染SOX21-AS1-WT及SOX21-AS1-MT的BXPC3与SW1990细胞的双荧光素酶实验报告；E：qRT-PCR检测干扰SOX21-AS1后BXPC3、SW1990中miR-31-5p的表达；F：qRT-PCR检测20例胰腺癌及邻近正常组织中miR-31-5p的表达；G：SOX21-AS1与miR-31-5p的相关性分析Figure 3 Analysis of the relationship between SOX21-AS1 and miR-31-5p A:The distributions of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells examined by nuclear cytoplasmic fractionation assay;B:The targeted binding sequence of SOX21-AS1 with miR-31-5Ppredicted by DIANA;C:The expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells after miR-31-5p overexpression;D:Relative luciferase activities in BXPC3 and SW1990 cells with miR-31-5p overexpression after transfection with SOX21-AS1-WT and SOX21-AS1-MT;E:Relative expression of miR-106a-3p in BXPC3 and SW1990 cells after SOX21-AS1 interference determined by qRT-PCR;F:Relative expression levels of miR-31-5p in 20 pairs of pancreatic cancer and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR;G:Correlation analysis between SOX21-AS1 and miR-31-5p expression

为了进一步验证SOX21-AS1靶向调控miR-31-5p的表达，进行了部分挽救实验，结果发现，在抑制miR-31-5p表达后，与对照组（si-NC）比较，挽救组（si-SOX21-AS1+miR-31-5p inhibitor）组胰腺癌BXPC3、SW1990细胞中miR-31-5p表达均明显降低（均P＜0.01）（图4A），提示该miR-31-5p抑制物有效。结果发现，在沉默SOX21-AS1后，miR-31-5p的表达明显上调，而在加入miR-31-5p抑制剂后，miR-31-5p的表达降低但仍明显于高于si-NC组（P＜0.05）（图4B）；同样地，在沉默SOX21-AS1后，SOX21-AS1的表达明显下调，而在给予miR-31-5p抑制剂后，SOX21-AS1的表达明显上调，但仍低于si-NC组（P＜0.01）（图4C）。此外，在对BXPC3和SW1990进行细胞活力检测后发现，与si-NC比较，si-SOX21-AS1#1组中细胞活力明显下降，在加入miR-31-5p抑制剂后出现明显好转（均P＜0.05）（图4D）。同时发现，在BXPC3、SW1990细胞中，与si-NC组比较，si-SOX21-AS1#1组中细胞增殖能力明显减弱，在加入miR-31-5p抑制剂后，其增殖能力明显恢复（均P＜0.01）（图4E）。综上提示，SOX21-AS1作为miR-31-5p的ceRNA在胰腺癌病程的发生发展中发挥作用。

图4 SOX21-AS1靶向调控miR-31-5p表达的验证A：qRT-PCR检测使用miR-31-5p抑制剂后BXPC3、SW1990细胞中miR-31-5p的表达量；B：qRT-PCR检测在BXPC3、SW1990细胞中，在si-SOX21-AS1质粒转染后加入miR-31-5p抑制剂后miR-31-5p的表达量；C：qRT-PCR检测在BXPC3、SW1990细胞系中，在si-SOX21-AS1质粒转染后加入miR-31-5p抑制剂后SOX21-AS1的表达量；D：MTT实验检测si-SOX21-AS1质粒转染后加入miR-31-5p抑制剂的BXPC3与SW1990细胞的细胞活力；E：细胞克隆实验检测在BXPC3、SW1990细胞中，加入si-SOX21-AS1质粒转染和在此基础上加入miR-31-5p抑制剂的细胞增殖能力Figure 4 Verification of targeted regulation of miR-31-5p expression by SOX21-AS1 A:The expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells transfected with miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;B:Relative expression levels of miR-31-5p in BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addiction of miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;C:Relative expression levels of SOX21-AS1 in BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addition of miR-31-5p inhibitors detected by qRT-PCR;D:Cell viabilities of BXPC3 and SW1990 cells transfected with si-SOX21-AS1 plasmids after addiction of miR-31-5p inhibitors detected by MTT assay;E:Proliferation abilities of BXPC3 and SW1990 cells after si-SOX21-AS1#1 transfection and miR-31-5p inhibitor addition detected by colony-forming assay

2.4 miR-31-5p的靶mRNA分析及验证

为了进一步确定SOX21-AS1影响胰腺癌病程的机制，在DIANA数据库预测了miR-31-5p靶位点，发现SOX21-AS1和MMP-16 mRNA包含与miR-31-5p相同的结合位点（图5A）。为了证实miR-31-5p与MMP-16之间存在相互作用，将MMP-16-WT与MMP-16-MT（与miR-31-5p模拟物的结合位点突变序列）克隆到双荧光素酶报告基因中，结果发现miR-31-5p模拟物明显降低了BXPC3和SW1990中MMP-16-WT的细胞的萤光素酶活性（均P＜0.05），但在MMP-16-MT荧光素酶活性未见明显变化（均P＞0.05）（图5B）。此外，在胰腺癌肿瘤组织中MMP-16的表达远高于正常胰腺上皮细胞的表达（P＜0.01）（图5C），同时，在进行miR-31-5p与MMP-16相关性分析后发现miR-31-5p的表达与MMP-16呈负相关（r²=0.311 3，P=0.010 6）（图5D）。以上结果表明，miR-31-5p可能通过调节MMP-16参与胰腺癌病程的发生发展。

图5 miR-31-5p靶向调节MMP-16 A：DIANA预测MMP-16与miR-31-5p中结合的靶向序列；B：加入miR-31-5p模拟物后，转染MMP-16-WT与MMP-16-MT的BXPC3细胞与SW1990细胞的双荧光素酶实验；C：qRT-PCR检测20例胰腺癌及邻近正常组织中MMP-16的表达量；D：MMP-16与miR-31-5p的相关性分析Figure 5 Target regulation of MMP-16 expression by miR-31-5p A:The targeted binding sequence in miR-31-5Pwith MMP-16 predicted by DIANA;B:Relative luciferase activities in BXPC3 and SW1990 cells transfected with MMP-16-WT or MMP-16-MT after addition of miR-31-5p mimics;C:Relative expression levels of MMP-16 in 20 pairs of pancreatic cancer and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR;D:Correlation analysis between MMP-16 and miR-31-5p expressions

3 讨论

本研究发现，在胰腺癌组织和细胞系中SOX21-AS1水平升高，SOX21-AS1的下调抑制了胰腺癌细胞的活力和增殖。此外，还发现SOX21-AS1和miR-31-5p表达之间存在相互抑制，这说明SOX21-AS1在胰腺癌细胞中存在通过miR-31-5p介导的促癌作用。本研究还证明了SOX21-AS1可通过抑制miR-31-5p来正向调节胰腺癌细胞中MMP-16的表达。

越来越多的证据表明，SOX21-AS1在多种类型的肿瘤中均起着肿瘤启动子的作用。例如，在结直肠癌患者中观察到SOX21-AS1的显著高表达，而过表达的SOX21-AS1通过影响miR-145/MY06促进结直肠癌的发生进展[18]。SOX21-AS1在肝细胞癌[19]，胃癌[20]，三阴性乳腺癌[21]和骨肉瘤[22]中也上调。与这些报道一致，本研究观察到胰腺癌组织和细胞系中的SOX21-AS1水平分别高于正常组织和HPDE6细胞，这表明SOX21-AS1可能是胰腺癌中的促癌基因。

lncRNA可作为ceRNA发挥作用，从而消除了miRNA对它们的目标转录本的内源性抑制作用。通过核质分离试验及qRT-PCR检测，笔者猜测SOX21-AS1可能在胰腺癌中通过ceRNA方式起作用。为了解SOX21-AS1在胰腺癌中影响的潜在机制，生物信息学分析结果表明，SOX21-AS1中存在miR-31-5p的靶向序列，并已观察到miR-31-5p在致癌作用中起抑癌基因的作用。先前的研究[23]表明，miR-31-5p通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1），从而作为肾细胞癌的肿瘤抑制因子。在膀胱癌[24]，鼻咽癌[25]，胃癌[26]和肝细胞癌中[27]，miR-31-5p表达也降低。同样，本研究也确定在胰腺癌组织和细胞系中miR-31-5p减少。此外，本研究还发现SOX21-AS1的下调显著提高了miR-31-5p的水平，而在用miR-31-5p模拟物转染的胰腺癌细胞中，SOX21-AS1的水平却降低了；SOX21-AS1和miR-31-5p之间的互补对结合，并且进一步证明SOX21-AS1与胰腺癌组织中的miR-31-5p呈负相关。这些发现表明，SOX21-AS1和miR-31-5p可能会形成相互抑制的反馈回路。

本研究探讨了miR-31-5p是否会影响SOX21-AS1在胰腺癌细胞中的作用，结果揭示miR-31-5p抑制剂可以挽救SOX21-AS1的下调对胰腺癌细胞生存能力和侵袭的抑制作用。SOX21-AS1的下调通过调节miR-31-5p抑制了胰腺癌细胞的活力和侵袭力。但是，当前的研究不能排除SOX21-AS1也可能影响胰腺癌中其他miRNA或相关基因的可能性，这需要进一步的研究。同时，在线生物信息学数据库分析中，预测SOX21-AS1和MMP-16包含与miR-31-5p相同的结合位点。Zhang等[28]报道，miR-155通过靶向SOCS1和MMP-16促进乳腺癌细胞增殖和迁移。因此推测SOX21-AS1可能起抑制miR-31-5p的作用，从而正向调节MMP-16的表达。据相关文献报道，MMP-16能诱导肝癌[29]、胃癌[30]等多种恶性肿瘤的增殖与转移，而目前鲜有报道其在胰腺癌中的相关作用。本研究初步证明了SOX21-AS1能够通过抑制miR-31-5p正向调节MMP-16表达，继而增强胰腺癌细胞的增殖活力，这给未来MMP-16在胰腺癌中的研究提供了新的思路。

总之，胰腺癌组织和细胞系中的SOX21-AS1水平显著降低，SOX21-AS1表达的下调通过miR-31-5p水平的上调降低了细胞活力和侵袭。这些结果表明，SOX21-AS1是预测预后的关键分子标志物，并且有望成为胰腺癌治疗中的重要靶标。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。