德宏奶水牛乳腺组织CD36 基因的表达研究*

王梦迪，唐 娜，俞大阔，张永云，杨 忠 ，李卫真

(1.云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201；2.北京首农畜牧发展有限公司，北京 100176；3.云南农业大学 农科专业基础实验教学示范中心，云南 昆明 650201；4.云南生物制药有限公司，云南 昆明 650503)

水牛奶品质优良，其中脂肪和蛋白质含量分别约为8.29%和5.23%，营养价值远高于荷斯坦牛乳[1-5]。德宏水牛属于沼泽型水牛，是云南当地经过长期选择培育的优良地方牛种资源[6]。德宏水牛与泌乳性能优良的摩拉水牛、尼里—拉菲水牛等河流型水牛进行杂交，培育出产乳性能优良的德宏奶水牛。改良后的德宏奶水牛属于乳、肉、役兼用型水牛，是构建杂交育种体系的理想模型[7]。

分化抗原簇36 (cluster of differentiation 36，CD36)又被称为脂肪酸转位酶(fatty acid translocase，FAT)，存在于牛奶脂肪球膜[8]，是直接参与反刍动物组织中脂肪酸(fatty acid，FA)跨膜运输和脂肪细胞积累脂质的重要运载体。有研究表明：FAT/CD36可作为FA 转运和甘油三酯(triglyceride，TG)合成的关键基因[9-11]。韩立强等[12]研究表明：在小鼠泌乳中期，CD36的mRNA 相对表达丰度较高，且其mRNA 表达量可上调3 倍。BIONAZ 等[13]认为：随着泌乳的进行，CD36基因的mRNA 表达量增加，表明其在奶牛乳腺细胞摄取FA 时发挥关键作用，可作为泌乳性状的关键基因。本研究利用实时荧光定量PCR 法研究不同乳脂率德宏奶水牛乳腺组织中CD36基因mRNA 的表达水平，并与乳脂率进行相关性分析，以期揭示CD36基因在乳脂合成中的作用，为研究其与德宏奶水牛乳脂的合成机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及分组

选择同一养殖小区中饲养条件相同的健康德宏奶水牛216 头，采集乳样并测定其乳脂率。经测，大部分德宏奶水牛乳脂率约为7.5%，故以乳脂率(7.5±0.5)%为基准，将德宏奶水牛分为高乳脂率组(H 组，乳脂率＞8%)、中乳脂率组(M组，乳脂率为7%～8%)和低乳脂率组(L 组，乳脂率＜7%)。每组选取胎次相同、年龄相近、处于泌乳中期的德宏奶水牛各3 头，屠宰后采集乳腺组织，置于超低温冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂和仪器

试剂：RNAiso Plus RNA 提取试剂、Prime ScriptTMreagent Kit Perfect Real Time 和SYBR®Premix ExTaqTMII 购自TaKaRa 公司；RNA Fixer 组织RNA 保存液购自艾德莱生物科技有限公司。

仪器：电泳仪(型号：Power PacTMBasic)、凝胶成像系统(型号：GelDocTMXR)和荧光定量PCR 仪(型号：iCycler Thermal Cycler)购自Bio-Rad 公司；超净工作台(型号：SW-CJ-IF)购自上海博迅实业有限公司；高速冷冻离心机(型号：Thermo Biofuge Primo R)购自Thermo 科技有限公司；核酸蛋白定量检测仪(型号：Nano Drop Lite)购自Thermo 科技有限公司；乳成分分析仪(型号：Milko ScanTMFT120)购自上海技越国际贸易有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳脂率测定

每头试验牛采集乳样25 mL，采用乳成分分析仪测定乳脂率。

1.3.2 乳腺组织总RNA 的提取及反转录

乳腺组织总RNA 的提取及反转录参照孙政等[14]的方法进行，总RNA 提取后使用约1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3.3 荧光定量PCR 引物设计

根据NCBI 上提供的水牛CD36基因(NW_005784248.1)和β-肌动蛋白基因(β-actin，XM_006044278)序列，利用Primer 6.0 和 Oligo 7.0 软件分别设计引物序列(表1)并对其进行分析评价，选择评分高的适宜引物进行试验。

表1 CD36 基因与β-actin 基因引物信息Tab.1 Primer information of CD36 gene and β-actin gene

1.3.4CD36基因表达水平检测

采用实时荧光定量PCR 技术检测CD36基因表达丰度，反应体系设置为20 μL，包括SYBR®Premix ExTaqTMII 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，RNase Free dH2O 6.4 μL，cDNA 模板2 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃变性5 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40个循环；55 ℃，30 s，81个循环进行熔解曲线分析。

每个样品与内参β-actin均设置3个重复，以减小系统误差。在实时荧光定量PCR 反应结束后，用MyIQ 软件统计数据，并保存熔解曲线及扩增曲线分析，确定产物是否为单一片段，运用2-ΔΔCt法计算CD36基因的表达量。

1.3.5 数据统计与分析

采用SPSS 26.0 软件单因素方差分析各试验处理数据间的显著性；利用Pearson 相关系数法对CD36基因的mRNA 表达水平与乳脂率进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 乳脂率测定结果

由表2 可知：高乳脂率组(H 组)德宏奶水牛牛乳中的乳脂率极显著高于中乳脂率组(M 组)和低乳脂率组(L 组)(P＜0.01)，且M 组显著高于L 组(P＜0.05)。

表2 德宏奶水牛牛乳中的乳脂率(n=3)Tab.2 Milk fat content of Dehong dairy buffalo

2.2 乳腺组织总RNA 检测结果

由图1 可知：凝胶成像系统可观察到完整清晰的3 条带，得到符合试验需要质量标准的RNA；定量检测每个样品的RNA 含量及纯度表明：该RNA 有较高的纯度。

图1 德宏奶水牛乳腺组织总RNA 琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of total RNA of mammary gland tissue from Dehong dairy buffalo

2.3 CD36 基因的mRNA 表达水平

由图2 可知：高乳脂率组(H 组)的德宏奶水牛乳腺组织CD36基因mRNA 表达量极显著高于中乳脂率组(M 组)和低乳脂率组(L 组)(P＜0.01)，M 组也极显著高于L 组(P＜0.01)。

图2 德宏奶水牛CD36 基因表达水平Fig.2 Expression level of CD36 gene of Dehong dairy buffalo

2.4 CD36 基因表达水平与乳脂率相关性分析

德宏奶水牛乳腺组织CD36的mRNA 表达量与乳脂率呈极显著正相关(P＜0.01)，Pearson 相关系数为0.906。

3 讨论

乳腺是哺乳动物泌乳期合成乳汁的重要器官。乳腺腺泡是乳腺组织中主要的功能单位，其外部被毛细血管所围绕[15]，血管中的血液可以为腺泡提供物质和氧气，充足的营养可为乳汁合成提供必要条件。乳脂作为乳汁的主要组成成分，在营养方面发挥着不可忽视的作用。乳脂的主要成分是甘油三酯(TG)，约占总乳脂含量的98%。乳腺组织中乳脂合成所需的脂肪酸(FA)既可由乳腺组织合成，也可从血液中直接摄取[16]。有研究认为：乳腺上皮细胞能够利用从血液中摄取的FA 合成TG，在FA 被摄取进入乳腺上皮细胞的过程中，需要有特定的转运蛋白发挥作用，FAT/CD36 就发挥着极其重要的作用[13]。张航[17]研究FA 变化对乳脂的影响时指出：添加FA 可引起乳腺上皮细胞中TG 含量增加，添加饱和长链脂肪酸对TG 含量的上调作用更加显著，且乳腺组织中相关脂肪酸摄取和转运基因(CD36)的表达量最高。本研究表明：高乳脂率组(H 组)的德宏奶水牛乳腺组织CD36基因mRNA 表达量极显著高于中乳脂率组(M 组)和低乳脂率组(L 组)，M 组也极显著高于L 组，说明CD36基因可能是乳脂合成过程的重要功能基因。

CD36 作为一种乳脂球膜蛋白，在乳脂球膜上存在并表达，在FA 的转运过程中起重要作用；且在泌乳阶段，CD36的mRNA 表达量有所升高。吕艳涛[18]研究显示：过氧化物酶体增殖物激活受体α 调控靶基因CD36，其mRNA 在泌乳期的表达量明显高于妊娠后期。母猪乳腺组织中CD36基因表达量随泌乳逐渐升高，到泌乳高峰期时进一步升高。由此可知：在母猪泌乳过程中，FA 摄取与转运相关基因的表达不断升高。有研究发现：过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)的靶基因CD36参与FA 转运，PPARG基因敲除小鼠试验表明：PPARγ缺失导致TG 合成减少，这是由于负责FA 转运的FA 转运体CD36基因以及其他相关基因的mRNA 表达量下调所致[19]。许会芬[20]通过siRNA 介导的干扰技术对乙酰CoA 合成酶短链家族成员2 及ATP 柠檬酸裂解酶基因进行共同干扰，将siRNA 转染至山羊原代乳腺上皮细胞后，细胞内参与脂质合成代谢的相关基因(如CD36)的表达量明显下调，且脂滴沉积减少，TG 含量也有所降低。综上所述，CD36基因的mRNA 表达可以促进TG 合成，进而可能提高乳质量，但是CD36基因调控乳脂合成的机制还需要进一步研究。

4 结论

高乳脂率组(H 组)的德宏奶水牛乳腺组织CD36基因mRNA 表达量极显著高于中乳脂率组(M 组)和低乳脂率组(L 组)，M 组也极显著高于L 组。CD36基因的mRNA 表达水平与乳脂率呈极显著正相关关系，该基因的表达对德宏奶水牛乳质量的提高可能有显著作用。研究结果可为乳脂合成机制的研究提供科学依据。