黔中山地不同种植方式茶园土壤真菌群落特征

张健，徐明，陈驰，张姣，陈进

（1. 贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，贵州 贵阳 550025；2. 贵州贵茶（集团）有限公司，贵州 贵阳 550025）

微生物是土壤生态系统的重要生物组分，在土壤元素的生物地球化学循环中发挥着关键作用［1］。土壤微生物在保持土壤生态系统健康方面中发挥着不可替代的作用，它们可通过丰富多样的生活方式、代谢途径和复杂的生态网络关系，实现土壤生态系统的物质循环、污染物降解等生态功能［1－4］。真菌是全球生物多样性的重要组成部分，土壤真菌通过共生－寄生的相互作用影响动植物群落动态［2］。土壤真菌作为监测土壤质量变化和健康状况的一个重要指标，在评价生态系统健康与维护生态系统平衡中也发挥了关键作用［1，5］。

我国有着悠久的植茶历史与茶文化积淀。目前我国是茶园面积和茶产量、茶消费量等位居全球最高的国家［6］。伴随绿色可持续发展理念和茶产业多元途径的开发利用，我国茶园种植面积呈逐年增加的趋势［7］。但我国茶产业发展也面临着茶叶生产技术与科技创新、茶业专业技术人才与劳动力紧缺等诸多因素的影响；鉴于我国不同茶区地理生态环境、人文、种植管理等方面差异明显，亟待加强茶产业相关基础与应用的创新性研究［8］。近年来，以高原山地为主要地貌的贵州省，发挥其山地气候条件适于茶树生长的优势，已发展成为我国茶园面积种植最大的省份。

土壤微生物是土壤中最活跃且多样性最为丰富的组分之一，可作为反映茶园土壤质量及评价土壤生态系统可持续性的重要生物学指标［9］。土壤微生物在反映茶园环境与种植管理方面较为敏感，具有重要的生物指示作用［10］。目前有关茶园类型、施肥模式、遮阴、修剪等方面对土壤细菌群落报道相对较多［11－15］，针对现代茶园、古茶园及不同培肥管理茶园的土壤真菌群落已有相关报道［10，16，17，22］；但有关不同茶园种植方式对土壤真菌影响的研究却鲜有报道。本研究以黔中山地不同种植方式（新茶园、普通茶园和碾茶园）茶园土壤真菌群落结构与功能为研究目标，进一步分析影响黔中山地茶园土壤真菌群落的主要环境因子，以期为该区茶园生态管理提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

调查的山地茶园位于贵州省贵阳市花溪区久安乡境内，该区位于东经106°35′～106°37′，北纬26°30′～26°32′；久安乡地势起伏大，属中山山地地形，海拔1090～1400 m；年降雨量为1000～1100 mm，属亚热带季风性气候，年平均气温14.8℃，无霜期260 d；土壤类型主要为黄壤。久安乡地下煤矿资源丰富，曾经煤产业盛行；但由于地处阿哈湖畔上游，属贵阳市水源保护地水资源环境，于2010年开始，陆续全部关停了境内煤矿，依托久安乡境内丰富的古茶树资源和适宜茶树生长的地理气候条件转型发展生态茶园［18］。

1.2 样地设置及样品采集

选取了新茶园（Tx）、普通茶园（Tp）和碾茶园（Tn）3种不同种植管理方式的茶园样地，以周边马尾松林（Pinus massoniana，Mp）作为对照（表1），分别选取了2个样地重复。其中，新茶园由山地自然植被转化茶园种植，种植管理年限为7年，进行定形修剪和有机肥培肥管理；普通茶园种植管理年限为11年，采用轻修剪和有机肥培肥管理；碾茶园种植管理年限为11年，但其在株高（相较普通茶园矮）、遮阴处理、修剪（平行或弧型修剪）和采摘以及施肥等种植管理方面差异明显［15，19］。于2018年8月采集土壤样品，用土钻采集0～20 cm土层的六点混合土样。土壤样品经去掉石头、根系等杂质后，全部过2 mm土筛，均匀混合后分为2份，一份经室内自然风干后用于测定土壤理化性质；另一份经冷冻干燥保存于-80℃冰箱，用于高通量测序的土壤总DNA提取。

1.3 土壤理化性质测定

pH值采用电位法（土水重量比为1∶2.5）测定；有机质（SOM）采用重铬酸钾氧化－分光光度法测定；全氮（TN）采用半微量凯氏定氮法测定；全磷（TP）采用钼锑抗比色法测定；有效磷（AP）采用双酸浸提－钼锑抗比色法测定；以上土壤指标的测定参照鲁如坤的《土壤农业化学分析方法》［20］。不同种植茶园样地基本信息描述见表1。

表1 调查样地基本信息Table 1 Basic information on sampling sites

1.4 土壤真菌ITS扩增子高通量测序

采用试剂盒（FastDNA®SPIN Kit for Soil）提取纯化土壤总DNA。土壤真菌ITS扩增子采用通用引物 为 ITS3F（5＇-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3＇）和 ITS4R（5＇-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3＇） 的核糖体RNA ITS2高变区进行测序，样品由上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina MiSeq PE300（2×300 bp）测序平台完成测序。

1.5 数据处理

经高通量测序得到的双端序列原始数据，根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接（merge）成一条序列，利用FLASH软件对reads质量和拼接效果进行质控过滤，再根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列。通过Uparse软件在相似水平为97%的OTU进行聚类分析；样品序列按最小序列抽平，本研究中每个样品按60540条序列进行抽平，通过QIIME软件获取OTU丰度、α多样性（包括Sobs、Shannon、Simpson、ACE和Chao等多样性指数）、稀释曲线和韦恩图；采用Welch T法检验不同茶园种植方式土壤真菌群落在属水平上组间的显著性差异，采用“fdr”法对P值进行多重检验校正，采用“Welch’s intverted”法计算95%的置信区间；基于非加权unifrac距离矩阵按照average算法进行层级聚类；采用加权标准化unifrac距离算法进行非度量多维尺度（Non-metric multidimensional scaling，NMDS） 和相似性检验（Analysis of similarities，ANOSIM）分析不同茶园种植方式土壤真菌群落样本间的相似性。采用典范关联分析（Canonical Correlation Analysis，CCA）揭示茶园土壤真菌群落与环境因子间作用关系。利用FUNGuild（http://www.funguild.org/）微生态工具按照营养方式对土壤真菌功能进行预测分析［21］。

2 结果与分析

2.1 不同种植方式茶园土壤真菌群落Alpha多样性特征

土壤真菌ITS扩增子高通量测序，共得到优化有效序列总数为574809，物种稀释曲线呈现出随着测得序列数量的增加逐渐趋于平坦（图1a），这表明测试有效序列数据信息量能够反映土壤样本真菌群落多样性。按＞97%相似度进行OTU注释，土壤真菌群落共鉴定得到13门、54纲、137目、315科、633属、1017种和2857 OTUs。其中，土壤真菌群落OTUs丰富度表现出（表2）：Tx（1636）＞Mp（1354）＞Tp（1281）＞Tn（1197），且共有OTUs和特有OTUs分别占比为47.32%和52.68%（图1b）。不同种植方式茶园土壤真菌群落Alpha多样性均表现出Tx最高和Tn最小（表2）。

图1 不同种植方式下茶园和马尾松林土壤真菌的稀释曲线（a）和韦恩图（b）Fig. 1 Dilution curves （a） and Venn diagram （b） of soil fungi at different type tea plantations and surrounding P. massoniana forests

表2 不同种植方式下茶园和马尾松林土壤真菌群落的分类鉴定与多样性指数Table 2 Fungal community classification and diversity indices of soils at different type tea plantations and surrounding P. massoniana forests

2.2 不同种植方式茶园土壤真菌群落组成结构特征

茶园与对照马尾松林的土壤真菌群落组成间存在明显差异，且不同种植方式茶园土壤真菌群落间也存在一定差异。在门水平上，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为不同种植方式茶园和马尾松林土壤真菌群落的优势菌门（图2a），但二者在组成结构上存在明显不同；其中，子囊菌门与担子菌门间比例（A∶B）在茶园土壤真菌群落中约为（3.5～4.7）∶1，不同种植方式茶园土壤真菌群落的A∶B表现出：Tx（3.5∶1）＜Tp（3.8∶1）＜Tn（4.7∶1）；而在马尾松林A∶B比例约为0.92∶1；因此，子囊菌门是茶园土壤真菌中占有绝对优势门类群。不同种植方式茶园土壤真菌群落其他相对丰度占1%以上的门包括被孢霉门（Mortierellomycota，1.6%～5.9%）、毛霉门（Mucoromycota，1.1%～3.1%）和罗兹菌门（Rozellomycota，0%～1.3%），这些非优势门类群可能受到不同茶园种植方式的影响而表现的变化幅度更加剧烈。

不同种植方式茶园土壤真菌群落科水平的组成结构间存在明显差异（图2b），其中未分类刺盾 炱 菌 目（unclassified_o__Chaetothyriales，11.1%～25.6%）、曲霉菌科（Aspergillaceae，4.5%～21.2%）、 三 型 霉 菌 科（Trimorphomycetaceae，8.3%～ 11.9%）、 黏 毛 菌 科（Myxotrichaceae，3.7%～ 7.4%）、 被 孢 霉 科（Mortierellaceae，1.6%～ 5.9%）、 小 囊 菌 科（Microascaceae，0.9%～ 10.7%）、 丛 赤 壳 科（Nectriaceae，1.8%～5.3%）、未分类子囊菌门（unclassified_p__Ascomycota，1.1%～ 5.4%） 和 肉 座 菌 科（Hypocreaceae，2.1%～4.4%）等为茶园土壤真菌群落的优势科类群。

图2 不同种植方式茶园和马尾松林土壤真菌群落门和科水平上相对丰度Fig. 2 Relative abundance of fungal communities in soil of different type tea plantations and surrounding P. massoniana forests at phylum and family levels

2.3 不同种植方式茶园间土壤真菌群落相似性

对土壤真菌群落相似性进行层级聚类分析结果表明（图3a），茶园与马尾松林的土壤真菌群落聚为不同的类群；而且不同种植方式茶园土壤真菌群落也聚为不同的二级分支，相对于新茶园和普通茶园，碾茶园土壤真菌群落可单独聚为一个二级分支。基于土壤真菌群落距离排序的非度量多维尺度NMDS分析结果（图3b）具有很好的代表性（Stress＝0.018，小于0.1），进一步表明马尾松林与茶园土壤真菌群落间呈现明显分异，而且不同种植方式茶园土壤真菌群落也存在较为明显的分异。

图3 不同种植方式下茶园及马尾松林土壤真菌群落的层级聚类与非度量多维尺度分析Fig. 3 Hierarchical clustering and non-metric multidimensional scale analysis on fungal communities in soils at different type tea plantations and surrounding P. massoniana forests

2.4 不同种植方式茶园间土壤真菌群落差异分析

不同样地间土壤真菌群落相似性ANOSIM检验分析结果表明（图4a），马尾松林与茶园土壤真菌群落间存在显著性差异（P＝0.010），但不同种植方式茶园间土壤真菌群落差异未达显著程度（P＝0.065）。Mantel检验结果表明（图4b）土壤真菌群落矩阵与环境因子矩阵间存在显著性相关关系（P＝0.018）；经典范关联分析CCA排序结果表明，有机质和有效磷是黔中山地茶园土壤真菌群落具有重要影响的土壤因子。

图4 不同种植方式下茶园及马尾松林土壤真菌群落间相似性差异与典范相关分析Fig. 4 Similarity difference and canonical correlation analysis on fungal communities in soils at different type tea plantations and surrounding P. massoniana forests

不同种植方式茶园土壤真菌群落差异显著的属类群间存在明显差异（图5）。新茶园与普通茶园间（Tx vs. Tp）土壤真菌群落间有4个属表现出显著性差异（图5a），分别为绿僵菌属（Metarhizium）、未 分 类 煤 炱 目（unclassified_o__Capnodiales）、树枝担菌属（Basidiodendron）和未分类壶菌门（unclassified_p__Chytridiomycota）。新茶园与碾茶园间（Tx vs. Tn）土壤真菌群落有9个属呈显著性差异（图5b），分别为未分类刺盾炱菌目（unclassified_o__Chaetothyriales）、绿僵菌属（Metarhizium）、头宽盘菌属（Phialocephala）、未分类微球黑粉菌纲（unclassified_c__Microbotryomycetes）、胶柄壳属（Collophora）、未分类座囊菌纲（unclassified_c__Dothideomycetes）、土生空团菌属（Cenococcum）、鬼伞属（Coprinellus）和未分类壶菌门（unclassified_p__Chytridiomycota）。普通茶园与碾茶园间（Tp vs. Tn）土壤真菌群落有6个属表现为显著性差异（图5c），分别为刺盾炱菌目（unclassified_o__Chaetothyriales）、拟棘壳孢属（Pyrenochaetopsis）、柱孢属（Cylindrocarpon）、林地小片耳属（Holtermanniella）、树枝担菌属（Basidiodendron）和须散囊菌属（Connersia）。(接下一页）

图5 不同种植方式下茶园土壤真菌群落属水平组间差异Fig. 5 Differences in fungal communities in soils of different type tea plantations at genus level

2.5 土壤真菌群落功能预测分析

真菌的生态功能类群是基于共生（Symbiotroph）、腐生（Saprotroph）和病理（Pathotroph）三种营养型来划分的。通过FUNGuild数据库对土壤真菌功能分类进行统计，结果表明，马尾松林与茶园土壤真菌功能类群组成结构间存在明显差异（图6），主要表现为外生菌根真菌（34.4%）和外生菌根－兰科菌根－根活体营养相关（8.8%）类群是马尾松林土壤真菌群落优势的功能类型，而它们在茶园土壤真菌群落中占比则很小；这一结果与马尾松（属典型外生菌根真菌宿主）和茶树（属丛枝菌根真菌宿主）为不同菌根型植物及其群落的共存植物组成状况是相对一致的。茶园土壤真菌优势功能类群主要包括未定义腐生真菌（undefined saprotrophs，21.0%～37.7%）、真菌寄生－未定义腐生生物（Fungal Parasite-Undefined Saprotroph，8.4% ～13.4%）、杜鹃花类菌根真菌（Ericoid Mycorrhizal，3.7%～7.4%）、内生真菌－凋落物腐生营养－土壤腐生营养－未定义腐生营养（Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-Undefined Saprotroph，1.6%～5.9%）和动物病原体－内生真菌－地衣寄生虫－植物病原体－土壤腐生物－木腐生物（Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph，1.5%～4.8%）、动物病原体－内生真菌－植物病原体（Animal Pathogen-Endophyte-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph，0.3%～3.9%）等，它们共占茶园土壤真菌功能类群相对丰度的50.3%～58.4%；另外，未知功能真菌类群（Unknown）占31.4%～34.6%，这些相关土壤真菌的生理生态功能有待进一步深入研究。

图6 不同种植方式茶园与马尾松林土壤真菌群落功能组成Fig. 6 Composition of soil fungal communities at different type tea plantations and surrounding P. massoniana forests

3 结论与讨论

土壤真菌结构与功能特征在反映茶园土壤环境质量与健康方面提供着重要的依据。本文探讨了黔中山地不同种植方式茶园土壤真菌群落组成、结构与功能特征。结果表明：子囊菌门和担子菌门为茶园土壤真菌群落的优势门类群，二者占土壤真菌群落相对丰度的88.2%～96.7%（图2a），尽管对照马尾松林土壤真菌群落子囊菌门和担子菌门也是优势门类群，且占土壤真菌群落相对丰度的89.8%，这一比例与新茶园更为接近；但茶园与马尾松林土壤真菌群落中子囊菌门与担子菌门间比例（A∶B）上却存在显著差异；其中，不同种植方式茶园土壤真菌群落A∶B表现为Tx（3.5∶1）＜Tp（3.8∶1）＜Tn（4.7∶1）；而在马尾松林A∶B比例约为0.92∶1。这一结果与云南西双版纳州报道的森林和现代茶园土壤真菌群落中A∶B比例较为一致［10］；可见，子囊菌门在茶园土壤真菌群落中占有绝对优势；而在外生菌根真菌宿主为主要林分的马尾松林中子囊菌门与担子菌门间比例则相对均衡；因此，针对不同植被类型土壤真菌群落子囊菌门与担子菌门格局形成机制有待进一步深入研究。

土壤真菌群落不同科类群随茶园的不同种植方式表现出不同的变化方式。本研究中茶园土壤真菌群落中未分类刺盾炱菌目（unclassified_o__Chaetothyriales）为科水平相对丰度最高的类群，在碾茶园土壤真菌群落的相对丰度（25.6%）明显高于新茶园（11.8%）和普通茶园（11.1%）；另外，本研究中该类群共包含了130个OTUs，目前这些OTUs功能均未得到注释，这也意味着黔中山地土壤真菌该类群真菌物种多样性有待进一步深入探索。曲霉菌科（主要为腐生真菌）在碾茶园土壤真菌群落的相对丰度（21.2%）也明显高于新茶园（4.5%）和普通茶园（5.7%），这与未分类刺盾炱菌目的变化趋势相似；而被孢霉科、丛赤壳科和未分类子囊菌门在新茶园和普通茶园土壤真菌群落的相对丰度（5.9%和5.0%、3.7%和5.3%、3.9%和5.4%）明显高于碾茶园（1.6%、1.8%和1.1%）；本研究中茶园土壤真菌群落被孢霉科仅包含的被孢霉属（Mortierella）1个属，其一般作为有益菌，可诱发系统性抵抗和促进植物生长，加强对植物病原体抵抗；而赤壳科主要包括了世界广泛地分布于土壤和有机体内的镰刀菌属（Fusarium）和其它少量的病原真菌和腐生真菌，如丽赤壳属（Calonectria）、柱孢属（Cylindrocarpon）和泥赤丛壳菌属（Ilyonectria）等；这预示着变化趋势相似的土壤真菌类群，但它们在生态功能并不趋同，不同种植方式茶园土壤真菌群落结构上的变化可能是真菌群落构建机制中不同物种间相互作用的动态权衡。

茶园土壤真菌群落的结构与功能受到茶树品种、植茶年限、施肥管理、种植管理、土壤环境等方面的影响［10，16，22，23］。本研究中调查的不同种植方式茶园土壤真菌群落在组成、结构和功能上存在着明显的差异（图3～6）。其中，不同种植方式茶园土壤真菌群落OTUs丰富度表现出（表2）：Tx（1636）＞Tp（1281）＞Tn（1197），这表明新茶园随种植年限和管理强度对土壤真菌多样性有下降趋势影响，这可能与茶园土壤酸化、茶树修剪物的降解产物和茶树本身固有的酚类物质对茶园的真菌群落有一定的抑制作用有关［23，24］。目前有关茶园土壤真菌群落多样性随种植茶树年限变化的研究仍较少、且结果不尽一致［23，24］，这可能由于受到选择茶园地理气候条件、种植年限梯度、管理方式及样品检测方法等影响；可见，针对茶园土壤真菌群落演变机制的研究有待加强。

层级聚类分析和NMDS分析结果表明，不同种植方式茶园土壤真菌群落存在明显的分异（图3），碾茶园与新茶园和普通茶园土壤真菌群落间的相似性较小。可见，碾茶园由于茶树高度控制、遮阴处理和机械收割等种植管理差异因素，可对土壤真菌群落产生了更加深刻的影响。茶园土壤真菌群落通过FUNGuild功能分类结果表明，马尾松林与茶园土壤真菌功能类群组成结构存在明显差异（图6），这可能是由于不同植被类型会通过植物－真菌－土壤间的协同演变与生境的环境质量改变，进而直接和间接地影响土壤真菌群落多样性与功能特征［25，26］。不同种植方式茶园土壤真菌功能类群组成结构也存在一定差异，这可能主要由于不同人为种植干扰方式的差异影响着茶园的土壤环境和微生境，以及茶树的生长状况，进而间接的影响着土壤真菌群落多样性及功能特征。本研究茶园生境中杜鹃花类菌根真菌占有一定比例，针对该类菌根真菌特征也有待进一步探索。另外，土壤的非生物因子往往对土壤真菌群落产生重要影响，如pH、C/N和SOC等［25，26］。本研究通过CCA分析结果表明，有机质和有效磷是茶园土壤真菌群落重要的土壤环境影响因子（图4），该结果与已报道的茶园土壤真菌重要影响的土壤因子相对一致［10，24］；这也预示着在茶园种植管理过程中应注意茶园土壤C和P养分的科学管理，可作为对茶园土壤真菌群落的一种潜在的生态调控方式。