CyclinD1、p27在非小细胞肺癌中的表达及与临床病理特征、术后复发的关系

闫晓红，王伟，袁玥，赵亚宁

（宝鸡市中心医院 肿瘤内科，陕西 宝鸡721008）

肺癌占我国城市居民恶性肿瘤致死疾病的首位，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）较为常见，在所有肺癌患者中占比约为80%[1]。调查显示[2]，NSCLC 患者确诊时多处于中晚期，5年生存率低至50%，即使手术切除，术后1年复发率仍可高达20%～60%，5年生存率仅约为60%。研究NSCLC 患者术后复发的影响因素十分必要。细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p27 蛋白均是细胞生长周期的调控因子。CyclinD1 定位于染色体11q13，在细胞周期G1 向S 期转化过程中起关键作用，可增强癌细胞的增殖活性，在NSCLC、宫颈癌等多种恶性肿瘤组织中高表达[3-4]。p27 定位于染色体9p21，是细胞周期调控的关键因子，能够抑制细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的活性，其表达水平越低，细胞的增殖活性越强，在NSCLC、胃癌等恶性肿瘤组织中低表达[5-6]。研究[7]提示NSCLC 患者癌组织中CyclinD1 蛋白阳性表达率高，p27 蛋白阳性表达率低。本研究回顾性分析125 例NSCLC 患者的临床资料，探讨CyclinD1 蛋白和p27 蛋白与NSCLC 患者临床病理学特征、术后复发的关系，旨在为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

回顾性分析2016年5月—2018年3月宝鸡市中心医院就诊的125 例NSCLC 患者的临床资料。纳入标准：①经手术切除且术后病理确诊为NSCLC；②术后接受跟踪随访，随访时间≥1年（病情进展死亡除外）；③有完整的病历资料。排除标准：①复发性或转移性NSCLC；②随访期间非NSCLC 原因死亡；③脏器功能不全、精神异常或认知障碍；④本人或家属拒绝调阅、回顾其临床资料。125 例NSCLC 患者中，男性82 例，女性43 例；年龄41～77 岁，平均（61.52±7.89）岁，≥60 岁68 例，＜60 岁57 例；肿瘤直径3.2～11.5 cm，平均（6.85±1.02）cm，最大肿瘤直径＞5 cm 者73 例；临床分期Ⅰ期7 例，Ⅱ期52 例，Ⅲa 期66 例；分化程度低分化34 例，中分化59 例，高分化32 例；病理类型鳞癌74 例，腺癌41 例，大细胞癌10 例。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学SP 法检测CyclinD1、p27 蛋白表达 鼠抗人CyclinD1、p27 单克隆抗体、兔抗鼠CyclinD1、p27 多克隆抗体购自英国Abcam 公司，免疫组织选项SP 试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司。取研究对象的癌组织和癌旁组织（距离癌组织≥2 cm）石蜡标本切片，厚度4 μm。取鼠抗人CyclinD1、p27 单克隆抗体、兔抗鼠CyclinD1、p27 多克隆抗体（以辣根过氧化酶标记）依次处理切片。所有组织切片采用微波修复受损的抗原，按照免疫组织化学SP 试剂盒说明书操作，添加二氨基联苯胺溶液显色，苏木精复染。阴性对照为磷酸盐缓冲液代替一抗的标本，阳性对照为已知的阳性片。由病理科2 位副主任医师在光学显微镜下观察染色强度和范围，随机选取10 个不重复高倍镜视野，采用盲法评价蛋白表达情况。染色强度评分：未着色0 分，淡黄或浅黄色1 分，黄色2 分，棕褐色3 分。阳性细胞百分比评分：染色细胞占视野细胞的1%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%为4 分。计算2 项得分的总和，结果为0～1 记为蛋白阴性表达，否则记为蛋白阳性表达[8]。若2 位副主任医师评价结果一致，则如实记录；若评价结果不一致，则交由本院第三方（临床研究中心）裁定。

1.2.2 随访 患者随访时间为1～3.5年。所有患者均于术后1 个月、3 个月、6 个月、9 个月、12 个月定期到院复查，不适随诊，利用影像学检查观察是否有残端病变，并结合病理学检查确诊，若发现肿瘤切除残端有NSCLC 病变者记为复发，计算复发率。归纳可能影响NSCLC 患者术后复发的因素，包括性别、年龄、临床分期、分化程度、病理类型、术式、淋巴结清扫、术后放化疗、癌组织CyclinD1 蛋白表达、癌组织p27 蛋白表达等。

1.3 观察指标

①癌组织、癌旁组织CyclinD1、p27 蛋白阳性表达率；②不同临床病理特征患者癌组织CyclinD1、p27 蛋白阳性表达率；③复发和未复发患者癌组织CyclinD1、p27 蛋白阳性表达率；④癌组织CyclinD1、p27 蛋白表达与NSCLC 患者术后复发的关系。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0 统计软件。计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验，影响因素的分析采用Cox 逐步回归模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织和癌旁组织CyclinD1、p27蛋白阳性表达率比较

癌组织和癌旁组织CyclinD1、p27 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达率高于癌旁组织，p27 蛋白阳性表达率低于癌旁组织（见表1）。CyclinD1、p27蛋白主要表达于细胞核，癌组织和癌旁组织中CyclinD1、p27 蛋白表达见图1。

图1 癌组织和癌旁组织CyclinD1、p27蛋白的表达 （免疫组织化学×400）

表1 癌组织和癌旁组织CyclinD1、p27蛋白阳性表达率比较 [n=125，例（%）]

2.2 不同临床病理特征患者癌组织CyclinD1、p27蛋白阳性表达率比较

不同性别、年龄、最大肿瘤直径、病理类型患者癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同临床分期、分化程度患者癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ⅲa 期患者癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达率高于Ⅰ、Ⅱ期，低分化患者癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达率高于中高分化患者。不同性别、年龄、最大肿瘤直径、病理类型患者癌组织p27 蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同临床分期、分化程度患者癌组织p27 蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Ⅲa 期患者癌组织p27 蛋白阳性表达率低于Ⅰ、Ⅱ期，低分化患者癌组织p27 蛋白阳性表达率低于中高分化患者。见表2。

表2 不同临床病理特征患者癌组织CyclinD1、p27蛋白阳性表达率比较 例（%）

2.3 复发和未复发患者癌组织CyclinD1、p27蛋白表达比较

患者随访时间平均为（2.20±0.65）年，共79 例复发，复发率为63.20%（79/125）。复发和未复发患者癌组织CyclinD1、p27 蛋白表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），复发患者癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达率高于未复发患者，p27 蛋白阳性表达率低于未复发患者。见表3。

表3 复发和未复发患者癌组织CyclinD1、p27蛋白表达比较 例（%）

2.4 复发和未复发患者不同临床病理特征的比较

复发和未复发患者的性别、年龄、病理类型、术式比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；复发和未复发患者的临床分期、分化程度、淋巴结清扫、术后放化疗比较，差异有统计学意义（P＜0.05），临床Ⅲa 期、低分化均高于未复发患者，淋巴结清扫、术后放化疗均低于未复发患者。见表4。

表4 复发和未复发患者不同临床病理特征的比较 例（%）

2.5 NSCLC患者术后复发的影响因素分析

将术后复发设为因变量（复发=1，未复发=0），将临床分期、分化程度、淋巴结清扫、术后放化疗、癌组织CyclinD1 蛋白表达、癌组织p27 蛋白表达设为自变量，纳入Cox 逐步回归模型，α入=0.05，α出=0.10，结果：临床Ⅲa 期[=5.818（95% CI：1.926，6.981）]、低 分 化[=6.613（95% CI：2.507，7.669）]、癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达[=7.199（95% CI：2.147，7.958）]、癌组织p27 蛋白阴性表达[=5.339（95% CI：2.209，5.869）]是NSCLC 患者复发的独立危险因素（P＜0.05），而淋巴结清扫[=0.477（95% CI：0.341，0.597）]、术后放化疗[=0.486（95% CI：0.322，0.674）]是NSCLC 患者复发的保护因素（P＜0.05）。见表5。

表5 NSCLC患者术后复发的影响因素逐步Cox回归分析参数

3 讨论

NSCLC 的发生是多种因素共同作用的结果，目前已知的病因主要包括吸烟、职业和环境接触、肺部慢性感染病史、电离辐射、遗传、大气污染等，均可引起癌基因激活和抑癌基因失活，导致细胞恶性转化[9-10]。NSCLC 患者恶性肿瘤细胞增殖活性较正常细胞显著增强，但凋亡则显著减少，是恶性肿瘤生长的病理基础。因此，NSCLC 患者癌组织中增殖、凋亡相关调控蛋白均有不同程度异常表达，使得癌细胞增殖和凋亡失衡。研究指出[11]，NSCLC 患者术后复发的风险高，不仅与分化程度等病理特征相关，与增殖、凋亡相关调控蛋白异常表达也有紧密关联。但是目前人们对上述问题的认识和研究尚浅，需进一步探讨。

本研究癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达率高于癌旁组织，p27 蛋白阳性表达率低于癌旁组织；Ⅲa期、低分化患者癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达率高于Ⅰ、Ⅱ期，中高分化患者，p27 蛋白阳性表达率低于Ⅰ、Ⅱ期，中高分化患者。由此可知在NSCLC患者癌组织中CyclinD1 蛋白异常高表达，而p27 蛋白则异常低表达，两者与临床分期、分化程度均有密切关系，推测两者可参与NSCLC 的发生、发展。本研究术后复发率高达63.20%，低于既往ZHANG等[12]报道的40.3%，两者不一致的可能原因是本研究研究对象的随访时间长、临床Ⅲa 期占比高等。另外本研究还显示，术后复发患者癌组织CyclinD1蛋白阳性表达率高于未复发患者，p27 蛋白阳性表达率低于未复发患者，提示癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达、p27 蛋白阴性表达可能与NSCLC 患者术后复发的风险有关。CyclinD1 有转录调节作用，可调节许多转录因子及核受体影响细胞的增殖，还可调控细胞的分化程度，与恶性肿瘤的发生及发展均有密切关联。有研究发现[13]，NSCLC 患者CyclinD1 蛋白阳性表达率较良性疾病患者明显升高，且体外实验也证实CyclinD1 过表达可以使恶性肿瘤细胞持续增殖[14]，提示CyclinD1 蛋白阳性表达是NSCLC 发生和发展的危险因素。据此可以推测该蛋白表达水平越高，NSCLC 患者恶性肿瘤细胞的增殖活性越强，分化程度越低，在癌组织切除术后，残端也快速恶化，细胞也可大量增殖，增加术后复发的风险。p27 蛋白在多种恶性肿瘤组织中均被证实低表达，可以调控CyclinD1，还可阻断Rb磷酸化，促使细胞在G1 期停滞，控制细胞的增殖活性。在NSCLC 患者癌组织中p27 蛋白低表达使得对恶性肿瘤细胞增殖的控制作用减弱，可导致其迅速、大量增殖，使得肿瘤生长[15]。若p27 蛋白表达持续处于低水平，可增加疾病进展的风险，因此p27 蛋白阴性表达是NSCLC 患者术后复发的危险因素。本研究Cox 逐步回归分析结果证实，癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达、癌组织p27 蛋白阴性表达均是NSCLC 患者术后复发的独立危险因素，证实两者与该类患者术后复发风险密切相关，提示可将其作为预防复发治疗的作用靶点，据此探讨新的治疗方案以降低术后复发率。

本研究Cox 逐步回归分析结果还显示，临床Ⅲa期、低分化也是NSCLC 患者术后复发的独立危险因素，而淋巴结清扫、术后放化疗均是其保护因素，与既往国内外报道结果一致[16-18]。分析其中可能原因：临床分期越高，病情越严重，彻底切除肿瘤组织的难度越大，患者术后复发的风险也越高；低分化意味着肿瘤细胞的恶性潜能高，疾病进展的风险高，术后复发的风险也越高；淋巴结清扫可有效清除阳性淋巴结，避免恶性肿瘤细胞随着体液播散，从而可以降低术后复发率；术后放化疗可杀灭手术切除残端的恶性肿瘤细胞及微小病灶，降低复发率。

综上所述，NSCLC 患者癌组织中CyclinD1 蛋白阳性表达率高，p27 蛋白阳性表达率低，且与临床分期、分化程度均有关，术后复发风险高，且术后复发患者癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达率明显高于未复发患者，p27 蛋白阳性表达率明显低于未复发患者，临床Ⅲa 期、低分化、癌组织CyclinD1 蛋白阳性表达、癌组织p27 蛋白阴性表达均是术后复发的独立危险因素，而淋巴结清扫、术后放化疗则可降低术后复发的风险。本研究为NSCLC 患者术后复发的防控提供了新方向，但如何降低癌组织中CyclinD1 蛋白阳性表达率，提高p27 蛋白表达，并积极控制其他危险因素需更进一步研究探讨，可作为后期工作的重点方向。