血清总胆红素与非小细胞肺癌临床相关性的初步分析*

王茜 吴建春 骆莹滨 方志红 李雁

作者单位：上海中医药大学附属市中医医院肿瘤科（上海市200071）

肺癌是世界上发病率第二的恶性肿瘤，但死亡率却长期居于第一位[1]。空气中有害物质和病原体等的侵害，导致肺部易受到慢性损伤和炎症的伤害，这是肺癌发病率高的主要原因之一[2]。

氧化应激是由活性氧类、DNA 氧化、脂质过氧化和蛋白质氧化所介导的一种常见生理过程[3]。由于致癌因子的刺激、代谢活动的增强以及线粒体损伤等因素，氧化应激活动增加，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增多，肿瘤细胞比正常细胞面临更大的ROS 压力，氧化应激在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。通过ROS 介导的一系列氧化应激活动，可以引发原癌基因和抑癌基因突变，促进肿瘤细胞增殖，并通过增加基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表达促进肿瘤细胞转移[4]。然而，氧化应激作用可以在抗氧化剂的处理下得到控制[5]。

一直以来，胆红素被认为是血红素分解途径的最终产物，生物活性有限，其浓度的升高往往是肝脏疾病的标志。细胞通过胆红素-胆绿素循环作用积极维持胆红素在细胞内的平衡。胆红素的浓度主要取决于氧化压力的程度，一方面通过线粒体Cyp2A5 进行调节，另一方面通过尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1，UGT1-A1）对胆红素进行葡萄糖醛酸化，导致胆红素的水溶性增加并使其在胆汁中排泄[6]。胆红素之所以被认为是最有效的内源性抗氧化剂，是因为其在体外和体内都能产生保护性的脂质过氧化[7]。有证据表明，胆红素和胆红素代谢的相关产物在一些细胞活动中具有重要作用，包括细胞生长、迁移、分化以及免疫反应的调控等[8]。胆红素已被证实能够阻止肿瘤细胞的生长，并诱导细胞凋亡[9]。间接胆红素和胆绿素是芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）的强效内源性激活剂，AhR 作为一种配体，激活的转录因子可以作用于各种基因，参与胆红素的生物转化和运输[8,10]。AhR信号通路参与细胞凋亡、T 细胞介导的免疫反应、细胞增殖和分化的调节[11-12]，其介导机制被证明有助于胆红素的抗肿瘤作用[13]。血红素加氧酶（heme oxygenase，HMOX）和胆绿素还原酶（biliverdin reductase，BLVR）是胆红素代谢过程中的两种关键酶，细胞内胆红素-胆绿素循环由HMOX1/2 启动，并由BLVRA/B维持[8]。除产生胆红素外，BLVRA 以及HMOX1 可以从细胞膜转入细胞核，以氧化应激诱导的方式激活多种信号通路[14-15]。胆绿素和BLVRA 还被证明可以调节蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），PKC 是一种与肿瘤发生相关的激酶[16]。因此，调节血清总胆红素（total bilirubin，TBIL）及其代谢相关酶的水平或活性，可能成为预防或治疗肿瘤的新手段。

目前，关于胆红素在肺癌的临床意义及其与肿瘤免疫的关系研究内容有限。TBIL 是否与肺癌的发生发展有关，以及血清TBIL 是否通过炎症细胞影响肺癌患者抗肿瘤免疫功能的研究报道较少。本研究旨在通过分析非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血清TBIL 与临床病理特征的关系以及与炎症细胞之间的相关性，探讨其在肺癌发生发展中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2017年3月至2020年12月于上海中医药大学附属市中医医院就诊的NSCLC 患者的临床资料。纳入标准：1）经病理诊断（组织学或细胞学）确诊为腺癌或鳞癌；2）临床资料相对完整；3）卡氏评分（Karnofsky，KPS）≥60 分。排除标准：1）确诊除肺癌外的其他恶性肿瘤；2）合并严重肝肾功能不全。本研究经本院伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 记录患者的临床资料以及观察指标，包括年龄、性别、吸烟史、疾病史等一般资料，以及肿瘤相关病理特征，如肿瘤大小及数目、患病时间、肿瘤分期（采用第8 版TNM 分期系统）以及生活质量评定（采用Karnofsky 评分表，按0～100 评分）；

1.2.2 观察指标 所有研究对象均在早晨空腹采集静脉血，进行血常规、生物化学指标、肿瘤标志物以及细胞免疫检查。本研究记录的数据为患者在本院第1 次就诊时的检验结果。无病生存期（disease-free survival，DFS）通过电话或门诊复诊随访获取。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。计量资料使用Kolmogorov-Smirnov 检验是否服从正态分布，服从正态分布采用±s表示，独立样本非参数t检验比较组间差异；非正态分布的用中位数M（P25，P75）表示，Mann-WhitneyU检验进行组间比较。计数资料采用χ2检验。分类变量相关性分析采用Logistic 回归分析，检验效能采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）下面积评估。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清TBIL 水平与肺癌患者临床病理特征的关系

经正态性检验，年龄、患病时间呈非正态性分布，其他均为计数资料，因此采用独立样本非参数t检验对332 例患者TBIL 水平及患者的临床病理特征进行分析。结果显示，TBIL 在不同性别中表达存在差异，但在不同年龄段无显著性差异。在有无吸烟史患者中，TBIL 无显著性差异；在肿瘤病理特征中，TBIL 在有无淋巴浸润、有无远处转移以及不同TNM 分期患者中呈显著性差异（P＜0.05），但不同肿瘤大小以及患病时间中TBIL 无显著性差异（P＞0.05）。TBIL 水平与肺癌患者临床病理特征关系见表1。

2.2 Logistic 回归分析肿瘤分期的相关危险因素

根据肿瘤TNM 分期将患者分为（Ⅰ+Ⅱ期）组和（Ⅲ+Ⅳ期）组，二元Logistic 回归分析与其相关的危险因素。结果显示：性别、年龄和病程与肿瘤分期无明显相关性；代谢组学相关因素中，血清TBIL、白蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和尿素氮水平与肿瘤分期显著相关（P＜0.05）（表2）。通过ROC 曲线下面积评估TBIL 的检验效能，P＜0.05 时检验值有意义，其中，TBIL、白蛋白以及谷草转氨酶与肿瘤分期的相关性有统计学意义（图1）。

表2 二元Logitic 回归分析肿瘤分期病情程度的影响因素

2.3 TBIL 与NSCLC 患者炎症细胞的相关性分析

由于TBIL 在不同性别中差异分布，因此在男性和女性中分别进行分析。根据约登指数计算截点值，其中，男性TBIL 水平截点值为13.85 μmol/L，女性TBIL 水平截点值为9.85 μmol/L。将患者分为TBIL 高水平组和TBIL 低水平组，在NSCLC 患者中，男性患者TBIL 低水平组（27.85%）的淋巴细胞比例均值低于高水平组（31.60%），TBIL 低水平组（2.35）的中心粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil-lymphocyte ratio，NLR）中位数高于高水平组（1.76，P＜0.05）；女性患者中，低水平组（30.03%）的淋巴细胞比例均值TBIL 低于高水平组（32.85%），TBIL 低水平组的NLR、CD3、CD4 细胞比例均高于高水平组（P＜0.05，表3，4）。

表3 男性患者不同TBIL 水平炎症细胞表达情况

2.4 TBIL 对早期NSCLC 患者DFS 的预后预测价值

TBIL 在早期肺癌中表达水平高于晚期患者，为验证TBIL 是否能够抑制肺癌细胞的浸润和转移，选取224 例早期NSCLC 术后患者进行随访，采用Kaplan-Meier 生存曲线和Log-rank 检验分析血清TBIL 对DFS 的预测价值，结果发现，在正常值范围内，当女性患者TBIL＞9.85 μmol/L 时，患者具有较好的预后（P＜0.05），但在男性患者中TBIL 水平与DFS 无显著性相关（图2）。

表4 女性患者不同TBIL 水平炎症细胞表达情况

3 讨论

胆红素对于增加氧化压力的疾病具有防御作用。在一项大型前瞻性队列研究中，对2 662 例结直肠癌患者重复检测肝功能指标，并持续10年随访。该研究结果显示，血清TBIL 水平是影响结直肠癌发展和预后的独立因素，较高的血清TBIL 水平与较低的大肠癌风险有关[17]。Horsfall 等[18]针对英国生物库中的成年人开展了一项大规模孟德尔随机法研究，结果显示循环TBIL 每增加5 μmol/L，肺癌总发病率就会减少1.2/10 000 人/年。除此以外，在胃癌[19]、乳腺癌、心血管疾病[20]、胰腺炎[21]、代谢综合征以及呼吸系统疾病[22]中，均有证据表明较高水平TBIL 可以降低患病风险，并与良好的预后有关，这种结果可能与胆红素的抗氧化能力有关。临床上将胆红素用于肝功能评估，在肝细胞癌患者中，常用白蛋白-胆红素（albumin-bilirubin，ALBI）评分评估患者肝功能障碍严重程度，ALBI 较高提示肝功能障碍。近年来多项研究报道，ALBI 与其他恶性肿瘤的预后可能存在一定关联，如术前ALBI 评分与CA199 联合可作为胰腺癌预后的一项预测指标[23]。TBIL 有助于筛查和预防血管病变，避免发生严重的并发症，临床中也将TBIL 认为是糖尿病血管并发症的一个保护性因素[24]。

本研究中男性的中位数TBIL 水平为13.1 μmol/L，高于女性中位数TBIL 水平12.3 μmol/L，且差异存在统计学意义。这是由于男性的雌激素水平较低以及红细胞周转率较高，男性的TBIL 水平通常高于女性[25]。众所周知，吸烟是导致肺癌的主要原因，香烟烟雾中的自由基和氧化剂对DNA 的氧化损伤是导致肺癌发展的主要途径之一[26]。吸烟与血清TBIL 之间呈负相关，吸烟引起的炎症反应和抗氧化过程能够消耗胆红素[27]。研究发现有吸烟史的人群中TBIL＞17 μmol/L 的人群比TBIL＜5 μmol/L 的人群肺癌发病率低[18]。本研究中有吸烟史的肺癌患者中位数TBIL 高于无吸烟史者，但无显著性差异。考虑是因为本次纳入有吸烟史的病例仅77 例，占总样本量的23.2%，样本量偏差导致本次结果不具有代表性。

中性粒细胞和淋巴细胞都是炎症反应的重要组成部分，中性粒细胞由骨髓造血干细胞产生，主要参与人体的急性炎症反应，淋巴细胞由淋巴器官产生，是人体免疫应答功能的重要组成部分。研究发现，外周血的炎性细胞增多与肿瘤的发生发展有关。如中性粒细胞分泌转化生长因子-β 和基质金属蛋白酶2，通过改变肿瘤微环境促进肿瘤细胞生长和转移，而淋巴细胞在宿主抗肿瘤免疫作用中起保护作用，淋巴细胞的增加有利于癌症患者的预后[28]。慢性炎症是癌症的标志性特征之一，炎症细胞可以释放ROS，ROS 及其参与的氧化应激过程可以促进肿瘤细胞增殖、转移、血管生成及耐药[5,29]。大量研究数据表明，NLR 与肿瘤的发生发展密切相关，高水平NLR 往往预示着不良的预后情况[30]。本研究发现，在NSCLC 患者中，男性和女性患者的NLR 在TBIL 高水平组均低于低水平组。由此猜想，TBIL 与NLR 之间可能存在协同作用，共同在肺癌免疫调节中发挥抗肿瘤作用。另外，在女性患者中，CD3+T 细胞比例和CD4+T 细胞比例在TBIL 低水平组反而高于高水平组（P＜0.05）。有文献报道，胆红素对抗原提呈细胞和T 细胞能够产生免疫抑制作用[31]。并且AhR 通路参与了T 细胞介导的免疫反应，对调节性T 细胞和Th17 细胞的分化具有调节作用[32]。

早期肺癌的治疗主要是以手术为主。肿瘤的病理分期（TNM 分期）是重要的预后因素。本研究显示，在有淋巴结转移和远处转移的患者中，TBIL 水平较低，而不同肿瘤大小表达无显著性差异。因此，笔者猜想：在肿瘤进展期，TBIL 作为内源性抗氧化剂可能被消耗。胆红素除了抗炎、抗氧化作用，对血管损害也有一定预防作用。如胆红素水平联合血清C 反应蛋白可作为诊断肝癌合并大血管侵袭的早期标志物，根据这两项指标的检测值可以预估发生大血管侵袭事件的概率[33]。TBIL 水平可能与肿瘤的浸润、转移存在一定关系。另外，本研究随访了224 例早期肺癌术后患者的TBIL 水平及DFS，发现当女性患者TBIL＞9.85 μmol/L 时具有良好的预后，但在76 例男性患者中没有发现相同的趋势。目前，TBIL 单个指标或联合其他指标已经用于一些疾病进展及预后的预测，临床中也证明了通过补充抗氧化剂可以改善癌症治疗的不良反用[34]。本研究数据也再一次提示，当TBIL 处于较低水平（男性＜13.85 μmol/L，女性＜9.85 μmol/L）时，联合抗氧化剂治疗可用于改善治疗效果。

以上多项结果提示适当升高的TBIL 可有效降低肺癌的进展风险，但目前还尚无切实可行的研究方案将胆红素的抗氧化功能用于相关疾病的治疗或预防。针对早期没有发生淋巴结转移或远处转移的患者如何预防复发转移，胆红素水平偏低患者给予抗氧化剂是否能够延缓肿瘤的浸润和转移，尚需进一步研究。本研究为小规模的临床资料回顾性分析，具有一定局限性。目前，大多数临床研究也是通过诊断后收集的血液样本进行循环代谢组学特征研究，这些数据可能受到化疗、手术、生活方式等因素的影响而出现偏差，然而这些混杂因素没有得到适当的控制[35]。因此，应对这些因素进行合理划分，展开大型流行病学研究，进一步明确血清TBIL 对肿瘤发生发展的影响。