基于网络药理学的过敏煎治疗过敏性哮喘分子机制研究∗

陶 鑫，薛中峰，覃骊兰

广西中医药大学，广西 南宁 530001

过敏性哮喘是一种以IgE 介导的，由变应原引发的过敏性哮喘疾病，易感人群容易出现喘息、气促、胸闷和咳嗽等由炎症引起的症状［1］。过敏性哮喘是一种相对难以治愈的疾病，如果忽视治疗，则迁延不愈甚至伴随终生。过敏性哮喘属中医学“哮证”范畴［2］，病机多以痰为主，由肺脾肾功能失常导致。津液凝聚，痰聚于肺，受外邪、情志、饮食等因素引而发之。

现代医学治疗过敏性哮喘多用地塞米松肾上腺皮质激素，疗效不甚理想，且有严重的副作用如满月脸、水牛肩等。中医药以整体调节的优势在防治哮喘复发和加重方面具有确切作用［3］。

过敏煎（Guomin Jian，GMJ）为名老中医祝湛予所创名方，临床常用于治疗多种过敏性疾病，如过敏性哮喘、过敏性皮炎、肠易激综合征等。方中防风发散解表，善于祛风，善治诸般风疾；银柴胡清热凉血，发散风寒；五味子味酸性温，固精敛汗；甘草补脾益气，全方正合哮证病机。防风的主要成分为防风色酮、升麻素，具有解热、抗炎功效；银柴胡的主要成分为甾醇类、环肽类，有抗炎、扩张血管作用；五味子含五味子素、五味子多糖，具有兴奋呼吸中枢，止咳祛痰作用；甘草含有甘草苷和甘草酸，具有抗菌消炎作用。由于中药复方成分复杂，作用机制不清，发掘复方的潜在分子机制仍然困难。随着网络药理学的提出，单一靶标的研究逐步转向整体、系统的调节研究，通过生物数据库构建“中药-有效成分-靶基因-疾病”可视化中药调控网络，进而阐明中药复方的作用机制，实现分子作用的综合网络分析，最终从整体角度了解中药与机体的相互作用［4-5］。因此，本研究运用网络药理学方法研究过敏煎治疗过敏性哮喘的作用机制，进行从单一到整体、从部分到系统的研究，现报道如下。

1 方法

1.1 复方有效成分及靶点获得通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）检索过敏煎中药的化学成分，并根据化合物类药性（drug-likeness，DL）＞0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%筛选药物活性成分。通过Uniprot 数据库规范筛选出的靶点名称，建立药物活性成分靶点数据集的Drug.txt文件。

1.2 疾病相关基因获得检索词：Allergic asthma，在Genecards（https：//www.genecards.org/）与OMIM（https：//omim.org/）两个数据库中检索疾病相关基因；将上述预测靶基因合并作为疾病相关基因数据的Disease.txt文件。

1.3 药物治疗疾病的可能靶点获得采用Draw Venny Diagram在线程序（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将Disease 和Drug 靶基因取交集获得单味药与疾病的共同靶点，此集合为单味药治疗疾病的可能靶点，生成Drug-Disease.txt文件。

1.4 药物、疾病、靶基因网络图绘制采用Cytoscape 3.7.1绘制药物、疾病、靶基因网络图。

1.5 PPI 网络构建将Drug-Disease.txt 中的基因提交至String 网站（https：//string-db.org/），minimum required interaction score为highest confidence：0.900生成PPI互作网络图及string-interactions.tsv 文件（使用0.900结果）。相关网络参数见文件夹下“参数.txt”。

1.6 统计条图生成利用perl语言，在stringinteractions.tsv 文件提取关键基因连接度蛋白统计条图（排名前30），所有节点连接度统计结果见count.xls文件。

1.7 基因名称转换为基因ID利用R3.6.0 软件，安装RSQLite 包及org.Hs.eg.db 包，将Drug-Disease.txt 中基因名称转换为基因ID，为京都基因(gene ontology，GO)和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析做准备，生成id.txt文件。

1.8 GO 分析利用R3.6.0 软件，安装Bioconductor 的colorspace、stringi、DOSE、cluster-Profiler、pathview、ggplot2等程集包，根据id.txt文件进行GO 富集分析，获得条图和气泡图（展示前20 条统计学最显著结果）；将基因id 转换为基因Symbol，获得所有统计显著性结果Excel 形式的统计文件GO.xls。利用ggplot2程集包进行GO的BP、CC、MF 分类输出，条图及气泡图存储在GO2文件夹下。

1.9 KEGG分析利用R3.6.0软件，安装Bioconductor 的colorspace、stringi、DOSE、cluster Profiler、pathview 等程集包，根据id.txt 文件进行KEGG 富集分析，获得条图和气泡图（展示前20 条统计学最显著结果）；将基因id 转换为基因Symbol，获得所有统计显著性结果Excel 形式的统计文件KEGG.xls及通路图文件。

2 结果

2.1 过敏煎的有效成分得到复方中银柴胡10个、乌梅8个、甘草91个、五味子8个、防风18个，共计141个活性成分。化合物主要包括：五味子素C（WuweizisuC）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（Stigmasterol）、异鼠李素（isorhamnetin）等，具体活性成分的OB（生物利用度）和DL（类药性）值见表1。

表1 过敏煎活性成分的OB和DL值（排名前30）

2.2 过敏煎活性成分-治疗过敏性哮喘靶点预测将TCMSP、DrugBank 数据库得到的所有靶点，由OMIM和Genecards数据库筛选整合得到过敏性哮喘相关作用靶点共1708 个，将过敏煎活性成分与过敏性哮喘相关靶点取交集得到134 个药物有效成分-疾病相关靶点。见图1。

图1 过敏煎活性成分靶点与过敏性哮喘的靶点预测结果

2.3 网络构建及分析通过Cytoscape 3.2.1软件将上述预测筛选结果构建网络：过敏煎活性化合物治疗过敏性哮喘靶点网络图见图2—3。

图2 过敏煎活性成分靶点与过敏性哮喘作用靶点

可知过敏煎治疗的核心靶点为STAT3、JUN、RELA、AKT1、MAPK1、MAPK3 等，为了进一步了解过敏煎对过敏性哮喘的治疗作用，将韦恩图得到的134 个交集基因靶点通过STRING 数据库进行PPI网络分析，结果见图4。

图4 过敏煎治疗过敏性哮喘潜在靶点之间的互作网络图

2.4 GO分类富集分析经DAVID数据库分析，共得到141 条富集结果，选取P 值排名前20 的做GO分类富集分析，结果显示过敏煎治疗过敏性哮喘的生物过程主要为细胞因子受体结合、细胞因子活性、蛋白磷酸酶活性与结合等。见图5。

图5 过敏煎治疗过敏性哮喘GO分类富集分析

2.5 KEGG 分类富集分析利用DAVID 数据库对过敏煎的基因进行KEGG 通路富集分析，共获得164 条通路，见图6。前20 条富集结果主要为AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号传导途径、TNF 信号通路、HIF-1 信号传导途径、Toll 样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路等。

图3 过敏煎治疗过敏性哮喘的重要靶点柱状图

3 讨论

中药成分复杂、配伍灵活的特点使其在过敏性疾病（过敏性哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹）的治疗中与西药相比具有优势，但其局限性在于起效较慢，作用机制不明确。伴随着网络药理学的兴起，大数据分析和“多成分-多靶点”研究方法的广泛应用为中药作用机制研究提供了新方法［6］。本研究通过网络药理学技术，结合对应的数据库和软件，对过敏煎治疗过敏性哮喘的作用机制进行研究，从方中防风、乌梅、银柴胡、五味子、甘草中筛选，共获得141 个活性成分，与疾病的交集基因靶点134个和164条通路，说明过敏煎治疗过敏性哮喘是多成分多靶点共同作用的结果。

本研究结果显示，在化合物靶点网络中异鼠李素（isorhamnetin）可以抑制肺肿瘤细胞A549的生长，从而抑制MMP2 和MMP9 蛋白表达［7］，β-谷固醇（beta-sitosterol）对LPS 所致小鼠急性肺损伤有较好保护作用，其保护机制可能与阻止炎症因子（TNF-α、IL-6）的释放和下调NF-κB 信号转导通路的活化有关［8］，山奈酚能够缓解氧化低密度脂蛋白诱导的人静脉内皮细胞损伤，这与山奈酚促进AMPK/Nrf2/HO-1信号通路的激活有关［9］。

GO 功能富集分析结果显示，过敏煎的疗效涉及多个生物过程，主要以细胞因子受体结合、细胞因子活性、蛋白磷酸酶活性与结合等为主，白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）主要是由Th17细胞分泌，是常见促炎因子，可以促进白细胞迁移和活化，在自身免疫性疾病、肿瘤等疾病中发挥重要作用［10］。

KEGG 通路分析显示，过敏煎治疗过敏性哮喘涉及多个通路，主要为AGE-RAGE 信号通路、IL-17信号传导途径、TNF 信号通路、HIF-1 信号传导途径、Toll 样受体信号通路等。大量研究发现，Th17 细胞是一类强有力的促炎细胞，可动员、募集和活化中性粒细胞，并与其所产生的细胞因子如IL17A、IL17F 等共同参与自身免疫性疾病如RA、哮喘、SLE、银屑病、MS等疾病的病理进展［11-12］。NF-κTHFα通路贝母素甲与TNF-α能下调炎症反应信号通路中MAPKs磷酸化水平，降低B基因的转录强度，从而减少TNF-α、IL-6 等促炎细胞因子表达［13］。故IL-17 信号通路和TNF 信号通路为本研究所预测的主要通路。用卵清蛋白诱导的哮喘小鼠Toll 受体模型、BML-111 或IL-1β抗体治疗均能阻止其炎症变化［14］。

综上所述，基于网络药理学方法和技术分析的过敏煎治疗过敏性哮喘的活性成分、靶点以及信号通路等，从多层次、多角度经过多次筛选重要活性成分，获得的重要信号节点是网络药理学的特点［15］。本研究从数据网络角度分析过敏煎治疗过敏性哮喘的作用机制，为以后探究过敏煎治疗机制提供了思路与基础，但具体作用机制还需进一步研究与验证。