RNAscope原位杂交技术在胃癌PD-1、PD-L1表达分析中的应用

缪小兵，沈 蓉，张邢松，尹海兵

程序性死亡受体-1(programmed death 1, PD-1)及其配体程序性死亡配体-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)在免疫调节中发挥重要作用。现已证实，PD-L1在多种肿瘤细胞和(或)肿瘤相关免疫细胞中表达异常。抗PD-1抗体已被批准用于胃腺癌的临床治疗。现阶段，通过免疫组化法评估PD-L1表达是预测抗PD-1/PD-L1免疫疗法是否有效的主要手段[1-2]。目前已有多个商品化PD-L1免疫组化抗体，不同抗体使用的检测平台、判读标准及相应的阳性阈值均不同，这可能会导致不一致的治疗选择[3]。RNAscope原位杂交技术是一种新型抗体非依赖性分析法，可在石蜡包埋组织中进行RNA原位杂交，因其特异性和可重复性较好而受到青睐[4]。本文通过RNAscope原位杂交、免疫组化法检测胃癌组织中PD-1、PD-L1的表达，探讨其在胃癌中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集2013年7月～2015年11月江苏省南通市肿瘤医院病理科确诊的胃癌石蜡标本255例，制作成组织芯片。其中男性197例，女性58例。患者年龄24～83岁，中位年龄66岁。所有患者术前均未行化疗或放疗。本实验经南通市肿瘤医院医学伦理委员会批准。

1.2 RNAscope原位杂交PD-1特异性探针(Hs-PDCD1)、PD-L1特异性探针(Hs-CD274)购自美国Advanced Cell Diagnostics公司，检测步骤按Advanced Cell Diagnostics公司RNAscope 2.5 HD试剂盒说明书进行。RNAscope结果判读：PD-1、PD-L1 mRNA阳性为细胞质或细胞核中有棕色点，呈棕黄色颗粒状，计数和得分如下：1～10个点/细胞为1分，11～15个点/细胞为2分，16～20个点/细胞为3分，>20个点/细胞为4分；将得分≥1分判断为细胞阳性[5]。PD-1 mRNA阳性信号定位于肿瘤间质免疫细胞，阳性细胞比例≥5%定义为PD-1阳性。PD-L1 mRNA阳性信号定位于肿瘤细胞或肿瘤间质免疫细胞，参考Yuan等[4]的标准，将肿瘤间质免疫细胞或肿瘤细胞≥1%阳性定义为PD-L1 mRNA阳性。

1.3 免疫组化一抗PD-1(UMAB199，稀释度1 ∶100)购自北京中杉金桥公司，PD-L1(22C3，稀释度1 ∶50)购自Dako公司，二抗及DAB购自Dako公司。免疫组化采用EnVision法，操作步骤严格按产品说明书进行，用已知阳性组织作为阳性对照。PD-1阳性定位于细胞质，按细胞着色程度：无阳性着色为0，淡黄色为1+，棕黄色为2+，棕褐色为3+。PD-1主要表达于肿瘤间质免疫细胞，着色2+和3+的细胞比例≥5%时定义为PD-1阳性[6]。PD-L1表达于肿瘤细胞或肿瘤间质免疫细胞。肿瘤细胞PD-L1阳性染色定位于细胞膜(部分或完全膜染色)，免疫细胞PD-L1阳性染色为细胞质或细胞膜染色。PD-L1评分采用联合阳性评分(combined positive score, CPS)法，CPS=PD-L1阳性细胞数(肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)/活肿瘤细胞总数×100，将CPS≥1定义为PD-L1阳性[7]。

1.4 统计学分析PD-1、PD-L1免疫组化及RNAscope检测结果比较采用McNemar-Bowker检验，一致性分析使用Kappa值，Kappa值<0.4代表两者一致性差，0.4≤Kappa值<0.6代表一致性中等，0.6≤Kappa值<0.8代表一致性较好，Kappa值≥0.8代表一致性很好[8]。采用Pearson χ2检验分析PD-1、PD-L1 mRNA表达与胃癌临床病理特征的关系。应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1、PD-L1免疫组化与RNAscope检测结果的一致性比较RNAscope检测显示：255例胃癌组织中PD-1 mRNA阳性52例，阳性率为20.39%(表1，图1)；PD-L1 mRNA阳性36例，阳性率为14.12%(表1，图2)。免疫组化检测显示：255例胃癌组织中PD-1蛋白阳性36例，阳性率为14.12%(表1，图3)；PD-L1蛋白阳性28例，阳性率为10.98%(表1，图4)。免疫组化与RNAscope检测的一致性分析显示：PD-1的一致性较差(Kappa=0.154，P=0.012)；PD-L1的一致性中等(Kappa=0.465，P<0.001，表1)。

图1 胃癌组织中肿瘤间质免疫细胞PD-1 mRNA阳性，RNAscope法图2 胃癌组织中肿瘤细胞及部分间质免疫细胞PD-L1 mRNA阳性，RNAscope法 图3 胃癌组织中肿瘤间质免疫细胞PD-1蛋白阳性，EnVision法 图4 胃癌组织中肿瘤细胞及少量间质免疫细胞PD-L1蛋白阳性，EnVision法

表1 RNAscope和免疫组化检测胃癌中PD-1、PD-L1表达结果的一致性

2.2 PD-1、PD-L1 mRNA表达与胃癌临床病理特征的关系PD-1、PD-L1 mRNA表达与患者性别、年龄、Lauren分型、pT分期、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结转移、pTNM分期及肿瘤直径均无关(P均>0.05，表2)。

表2 PD-1、PD-L1 mRNA表达与胃癌临床病理特征的关系

2.3 PD-1、PD-L1 mRNA表达与胃癌患者预后的关系Kaplan-Meier分析显示：PD-1 mRNA表达与患者总生存期(overall survival, OS)无关(P=0.270，图5A)；PD-L1 mRNA表达与患者OS相关，PD-L1 mRNA阳性患者较阴性患者的OS延长(P=0.017，图5B)。

图5 A.Kaplan-Meier法分析PD-1 mRNA表达与患者预后的关系;B.Kaplan-Meier法分析PD-L1 mRNA表达与患者预后的关系

3 讨论

人类PD-1由2号染色体上的Pdcd1基因编码，属于免疫球蛋白B7-CD28家族成员，是一种由288个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-1包含一个免疫球蛋白超家族结构域、一个由20个氨基酸组成的茎、一个跨膜结构域以及一个约95个残基构成的胞内结构域，其胞内结构域含免疫受体酪氨酸抑制基序以及免疫受体酪氨酸转换基序。PD-1可表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞、活化的单核细胞以及树突状细胞，而静止T细胞通常不表达PD-1。PD-L1(也称为CD274、B7-H1)是PD-1的配体之一，是一种由290个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白，人类PD-L1由9号染色体上的Cd274基因编码。PD-L1除在肿瘤细胞表达外，在T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞中也有表达[9-10]。

以PD-1和PD-L1为靶点的免疫治疗已在多种不同肿瘤中显示出较好的疗效。PD-L1蛋白是预测抗PD-1治疗(帕博利珠单抗)治疗反应的常用生物标志物。据报道，在非小细胞肺癌、胃腺癌、食管鳞状细胞癌、子宫颈癌、尿路上皮癌、三阴型乳腺癌以及头颈部鳞状细胞癌等肿瘤中，使用PD-L1 22C3 pharmDx评估PD-L1表达有助于预测患者是否可从帕博利珠单抗治疗中获益[11]。现阶段，有多个商品化PD-L1免疫组化抗体，不同抗体使用的检测平台、判读标准及相应的阳性阈值均不同，这可能会导致不一致的治疗选择。现已证实，并非所有商品化PD-L1抗体均具有特异性，RNAscope技术可能是一种可行的替代检测方法[12]。RNAscope技术是美国Advanced Cell Diagnostics公司开发的一项新型原位mRNA检测技术，根据碱基互补配对的原理可对特定基因的mRNA进行检测。RNAscope检测因不依赖于抗体，探针可重复生产等优势而受到重视[5, 13-14]。

李莹莹等[6]报道，RNAscope和免疫组化法检测非特殊型浸润性乳腺癌中PD-1、PD-L1表达的一致性较好。而在非小细胞癌中，RNAscope和免疫组化法检测PD-1的一致性较差，检测PD-L1的一致性一般[15]。在胃肠道间质瘤中，RNAscope和免疫组化法检测PD-1、PD-L1表达的一致性均一般[13]。本文通过RNAscope技术检测发现胃癌组织中PD-1 mRNA阳性率为20.39%，PD-L1 mRNA阳性率为14.12%；免疫组化检测显示胃癌组织中PD-1蛋白阳性率为14.12%，PD-L1蛋白阳性率为10.98%。免疫组化与RNAscope检测的一致性分析显示：PD-1的一致性较差，PD-L1的一致性中等。Yuan等[4]研究发现，在进展期胃癌中PD-L1 mRNA表达与患者性别、年龄、肿瘤分化、转移无关，与Lauren分型相关：PD-L1 mRNA在肠型胃癌中的表达显著高于弥漫型胃癌。与上述研究不完全相同，本实验结果显示，PD-1、PD-L1 mRNA表达与患者性别、年龄、Lauren分型、pT分期、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结转移、pTNM分期及肿瘤直径均无关。此外，Yuan等[4]研究亦发现，PD-L1 mRNA表达与进展期胃癌患者的OS以及无进展生存期(progression free survival, PFS)无关。本组结果显示，PD-1 mRNA表达与患者OS无关；但PD-L1 mRNA表达与患者OS相关，PD-L1 mRNA阳性患者较PD-L1 mRNA阴性患者OS延长。

综上所述，本实验结果发现RNAscope和免疫组化法检测PD-1的一致性较差，PD-L1的一致性中等；PD-1 mRNA表达与患者OS无关，但PD-L1 mRNA阳性患者较PD-L1 mRNA阴性患者OS延长。