子宫颈鳞状细胞癌中PDHA1的表达及临床意义

吴雅珣，张邢松，沈 蓉，朱兴华，贾美群

肿瘤细胞在氧充足的条件下依靠糖酵解，而不是氧化磷酸化作为能量来源的现象称为Warburg效应或有氧糖酵解。现已证实，有氧糖酵解可促进肿瘤的发生、发展。丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex, PDC)和丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase, PDK)是糖代谢途径中的关键线粒体酶，两者相互作用可以调节有氧呼吸与Warburg效应之间的比例。PDC通过催化丙酮酸氧化脱羧为乙酰辅酶A的限速步骤在氧化磷酸化和糖酵解中发挥连接作用[1-2]。PDC主要包含三种酶组成成分：丙酮酸脱氢酶E1亚基、二氢脂酰胺乙酰转移酶(E2亚基)以及脂酰胺脱氢酶(E3亚基)。PDK通过磷酸化丙酮酸脱氢酶E1亚单位α(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, PDHE1α)(又称PDHA1)调节PDC的活性[3]。文献报道PDHA1表达异常与多种肿瘤的发生、发展密切相关，包括胶质瘤[4]、胆管癌[5]、乳腺癌[6]、食管癌[7]、前列腺癌[8]、肝癌[9]。本组前期实验结果亦发现，PDHA1低表达与胃癌患者预后不良有关[10]。然而，PDHA1在子宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma, CSCC)中的表达及意义仍不清楚。本实验应用免疫组化EnVision法检测PDHA1在130例CSCC组织中的表达，分析PDHA1在CSCC中的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集2007年12月～2014年8月江苏省南通市肿瘤医院确诊的130例CSCC。所有患者术前均未接受放、化疗，收集患者的临床病理资料，并对患者进行随访。本实验经医院伦理委员会批准通过。

1.2 免疫组化免疫组化染色采用EnVision法，操作步骤严格按产品说明书进行。一抗PDHA1(sc-377092，稀释度1 ∶200)购自Santa Cruz Biotechnology公司。二抗及DAB购自DAKO公司。用已知阳性组织作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判读免疫组化评分采用组织化学评分(histochemistry score, H-score)。按着色强度：无阳性着色为0分，弱着色为1分，中等着色为2分，强着色为3分。H-score=3×强着色细胞百分数+2×中等着色细胞百分数+1×弱着色细胞百分数。H-score范围为0～300。将H-score<150定义为PDHA1低表达，H-score≥150定义为PDHA1高表达。

1.4 TCGA数据分析在线下载TCGA CSCC基因表达数据集，合计纳入252例CSCC，利用该数据集分析PDHA1 mRNA表达对患者总生存期(overall survival, OS)的影响。

2 结果

2.1 临床特征患者年龄29～75岁，中位年龄53岁，其中<45岁30例，≥45岁100例。无脉管癌栓111例，有脉管癌栓19例。肿瘤分化程度：高+中分化61例，低分化69例。浸润深度<1/3层62例，≥1/3层68例。肿瘤直径<4 cm 121例，≥4 cm 9例。无盆腔淋巴结转移110例，有盆腔淋巴结转移20例。FIGO分期：Ⅰ+ⅡA期110例，ⅡB+Ⅲ期20例。

2.2 PDHA1表达及其与CSCC临床病理特征的相关性PDHA1蛋白阳性定位于细胞质，130例CSCC中，PDHA1高表达70例，低表达60例(图1、2)。CSCC组织和对应癌旁鳞状上皮组织中PDHA1免疫组化H-score分别为150.5±5.004、67.38±4.629，其在CSCC组织中的表达高于对应癌旁鳞状上皮组织(P<0.000 1)。PDHA1表达与患者年龄(P=0.004)、肿瘤浸润深度(P=0.002)、盆腔淋巴结转移(P<0.001)以及FIGO分期(P<0.001)相关，其在年龄<45岁、浸润深度<1/3层、无盆腔淋巴结转移以及FIGO分期Ⅰ+ⅡA期组中表达较高；PDHA1表达与是否有脉管癌栓、肿瘤分化程度以及肿瘤直径无关(P均>0.05，表1)。

图1 A.CSCC组织中PDHA1高表达，EnVision法；B.对应癌旁鳞状上皮组织中PDHA1低表达，EnVision法 图2 A.CSCC组织中PDHA1低表达，EnVision法；B.对应癌旁鳞状上皮组织中PDHA1低表达，EnVision法

表1 PDHA1蛋白表达与CSCC临床病理特征的关系

2.3 PDHA1表达与CSCC患者预后的关系在TCGA数据集中，PDHA1 mRNA高表达CSCC患者较低表达患者的OS长(P=0.000 4，图3)。对本组130例CSCC患者进行生存分析发现：PDHA1蛋白高表达组较低表达组患者的OS长(P=0.029 3，图4)。单因素Cox回归分析显示：盆腔淋巴结转移(P=0.005)、FIGO分期(P=0.005)以及PDHA1表达(P=0.043)是CSCC患者预后的影响因素。多因素Cox回归分析显示：FIGO分期(P=0.037)是预后的独立影响因素。PDHA1表达水平是影响OS的相关因素，但不是预后的独立影响因素(P=0.151，表2)。

表2 CSCC患者预后的单因素及多因素Cox回归分析

图3 TCGA数据集中PDHA1 mRNA表达与CSCC患者OS的关系

图4 CSCC中PDHA1蛋白表达与患者OS的关系

3 讨论

正常细胞的糖代谢包括无氧糖酵解和有氧氧化磷酸化。与正常细胞不同，肿瘤细胞即使在氧充足的条件下也以糖酵解代谢为主，这种现象称为Warburg效应。PDC是一种门控多蛋白复合物，可催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A，从而调节线粒体活性。PDHA1是PDC的主要组成成分，可被丙酮酸脱氢酶磷酸酶PDP1和PDP2去磷酸化，也可被PDK磷酸化。PDHA1去磷酸化可激活PDC，而PDHA1磷酸化则可抑制PDC活性[11]。PDHA1表达及活性下降，则Warburg效应增强，加速肿瘤细胞分裂，肿瘤侵袭性增加[12]。

Liu等[13]报道，在食管鳞状细胞癌中，抑制PDHA1基因表达可增强Warburg效应，增强肿瘤细胞的增殖、迁移和耐药。Zhong等[7]研究发现，PDHA1与食管鳞状细胞癌分化程度有关，其在高分化肿瘤中表达较高。Sun等[9]报道，与癌旁肝组织相比，PDHA1在肝癌组织中表达下调，PDHA1表达与肿瘤大小、肿瘤分化、TNM分期相关，而与患者年龄、性别以及是否有肝硬化无关；在肝癌细胞中过表达PDHA1可降低PDH的活性并影响肿瘤细胞的代谢状态，从而抑制肿瘤细胞的增殖，并促进肿瘤细胞凋亡。本组前期实验发现，PDHA1 mRNA在肠型、弥漫型以及混合型胃癌中的表达水平显著降低；免疫组化结果显示PDHA1蛋白在胃癌组织中的表达显著低于癌旁胃黏膜组织，且PDHA1在低分化胃癌中的表达低于高+中分化胃癌；PDHA1表达与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期以及神经侵犯相关，而与患者性别、年龄、Lauren分型以及脉管侵犯无关[10]。本实验发现，PDHA1蛋白在CSCC组织中的表达(H-socre：150.5±5.004)显著高于癌旁鳞状上皮组织(H-socre：67.38±4.629)(P<0.000 1)。PDHA1表达与患者年龄(P=0.004)、肿瘤浸润深度(P=0.002)、盆腔淋巴结转移(P<0.001)以及FIGO分期(P<0.001)相关，其在年龄<45岁、浸润深度<1/3层、无盆腔淋巴结转移以及FIGO分期Ⅰ+ⅡA期患者中的表达较高；PDHA1表达与是否有脉管癌栓、肿瘤分化程度以及肿瘤直径无关(P均>0.05)。Zhong等[7]报道PDHA1低表达食管鳞状细胞癌患者预后不良。在卵巢癌中，PDHA1低表达与高FIGO分期以及较短的OS以及无进展生存期(progression-free survival, PFS)相关[14]。Sun等[9]报道，PDHA1低表达肝癌患者的OS显著缩短。本组前期实验发现，PDHA1低表达胃癌患者的OS显著缩短，PDHA1表达是胃癌预后的独立影响因素[10]。本研究发现，TCGA数据集中PDHA1 mRNA高表达CSCC患者较低表达患者的OS长(P=0.000 4)；本组对130例CSCC患者进行Cox生存分析发现：PDHA1蛋白高表达组患者较低表达组患者的OS长(P=0.029 3)；多因素生存分析显示：PDHA1表达水平是影响OS的相关因素，但不是预后的独立影响因素(P=0.151)。值得注意的是，“PDHA1高表达CSCC患者预后较好”似乎与“PDHA1在癌组织中的表达高于癌旁组织”相悖。有研究报道，敲低PDHA1表达可通过抑制脂肪生成抑制前列腺癌的形成[11]。因此，笔者推测早期阶段PDHA1可能通过某种或某些特定的机制促进肿瘤发生，随后PDHA1可能通过影响Warburg效应调控肿瘤的发展，而这一推论是否成立仍需后续实验研究加以验证。

综上所述，PDHA1在CSCC组织中的表达显著高于癌旁鳞状上皮组织，PDHA1在年龄<45岁、浸润深度<1/3层、无盆腔淋巴结转移以及FIGO分期Ⅰ+ⅡA期CSCC患者中的表达较高，PDHA1高表达CSCC患者较低表达患者的OS长。PDHA1表达水平是影响OS的相关因素，但不是预后的独立影响因素。