三阴型乳腺癌间质肿瘤浸润淋巴细胞CD4、CD8、Foxp3和PD-L1表达的临床病理意义

钟恋君，王进京，郑 洪

乳腺癌是全球女性中常见的恶性肿瘤之一，且肿瘤内部存在高度异质性，严重威胁着女性的生命健康[1-2]。三阴型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌中极具侵袭性的一种亚型，占所有浸润性乳腺癌的10%～20%，具有侵袭性强，恶性程度高，易复发和转移的特点，预后较差[3]。TNBC的主要生物学特征为缺乏ER、PR和HER-2的表达，有研究表明，TNBC中高密度间质肿瘤浸润淋巴细胞(stromal tumor-infiltrating lymphocytes, sTILs)是独立预后因素，并能够延长TNBC患者的总生存期(overall survival, OS)[4]。在sTILs的不同亚群中，肿瘤浸润性T淋巴细胞(TILs-T)在乳腺中发挥主要的抗肿瘤活性，包括CD4+(辅助)和CD8+(细胞毒性)sTILs[5-6]。另外，有研究认为高水平的Foxp3+Tregs与不良预后有关[7-9]，然而并未达成共识。此外有研究表明，相比其他乳腺癌亚型，TNBC肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中存在程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1, PD-L1)高表达[10-11]，这为发现乳腺癌治疗新靶点提供了依据。然而，目前针对CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs及PD-L1+sTILs在乳腺癌中的预后价值仍然存在争议，需要进一步研究以充分了解其意义。本实验旨在通过评估92例TNBC肿瘤区域内sTILs的浸润密度，并采用免疫组化EnVision法检测TNBC中CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs的浸润密度及sTILs的PD-L1蛋白表达情况，探讨TNBC中CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs的浸润密度和sTILs中PD-L1表达与临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集遵义医科大学附属医院2015～2019年收治的具有完整临床病理资料的女性TNBC标本92例，所有患者均未行放疗或化疗，且由两位副高以上职称病理医师阅片后明确诊断。92例TNBC患者中位年龄45岁(26～75岁)，肿瘤中位直径2.0 cm(1.0～7.0 cm)。组织学类型均为浸润性导管癌，其中低级别癌(组织学分级Ⅰ+Ⅱ级)44例，高级别癌(组织学分级Ⅲ级)48例。有淋巴结转移者22例；74例Ki-67增殖指数>20%。

1.2 方法对92例TNBC标本行免疫组化EnVision法染色。兔抗人CD4(SP35)、CD8(SP16)抗体及免疫组化EnVision法试剂盒均购自福州迈新公司，兔抗人Foxp3(10211R)抗体购自北京博奥森生物公司，兔抗人PD-L1(SP142)抗体购自上海罗氏诊断产品公司(Ventana检测平台)。以扁桃体组织作为阳性对照。染色步骤：标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。二甲苯脱蜡，乙醇分级水化，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液修复，PBS冲洗，滴加一抗后-4 ℃恒温箱中过夜，滴加山羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗处理，DAB显色。苏木精对比染色，盐酸乙醇分化、反蓝，乙醇分级脱水，封固。

sTILs结果判定标准：根据国际TILs工作组建议，sTILs评分定义为单核炎性细胞占据肿瘤基质面积的百分比。(1)首先在低倍镜下评估整张HE切片，观察sTILs分布是否均匀；(2)若sTILs分布较均匀，随机选取10个高倍镜视野计数，取平均数；(3)若sTILs分布不均匀，排除分布最高和最低区域，随机选取8个视野在高倍镜下计数，取平均数。

PD-L1结果判定标准：首先观察肿瘤细胞中免疫细胞(immunocyte, IC)的PD-L1染色情况，在肿瘤内和(或)肿瘤周围间质中任何强度PD-L1染色的IC所占肿瘤区域面积的百分比≥1%定义为阳性。

CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs结果判定标准：(1)首先在低倍镜下评估整张切片，观察肿瘤基质阳性细胞分布是否均匀；(2)若分布较均匀，随机选取5个高倍镜视野计数阳性细胞个数，取平均数；(3)若分布不均匀，排除分布最高和最低区域，随机选取3个视野在高倍镜下计数阳性细胞个数，取平均数。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。采用χ2检验(Chi-Square test)或Spearman秩相关性检验对分类变量进行相关性分析，应用Kaplan-Meier生存曲线及Cox比例风险回归模型对TNBC预后相关因子进行单因素和多因素分析。采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 sTILs中PD-L1表达及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs与TNBC临床病理特征的关系本组92例TNBC中，将sTILs浸润密度以10%和50%为临界值分为低密度组(≤10%)、中密度组(>10%，≤50%)和高密度组(>50%)(图1)，并进行HE切片评估，其中sTILs中任何强度PD-L1染色的IC所占肿瘤区域面积的百分比≥1%确定为阳性(图2A)，而CD4+(图2B)、CD8+(图2C)、Foxp3+(图2D)sTILs均以各自中位值为临界值进行分组将它们分为低密度组和高密度组。本实验检测得出：CD4+sTILs浸润密度(6～242)个/HPF，中位值为38个/HPF；CD8+sTILs浸润密度(8～298)个/HPF，中位值42个/HPF；Foxp3+sTILs浸润密度(4～34)个/HPF，中位值8个/HPF。

图1 TNBC中肿瘤细胞呈片状或条索状排列并浸润周围间质，其肿瘤细胞团周围间质见数量不等的淋巴细胞浸润：A.低密度sTILs(≤10%)；B.高密度sTILs(>50%) 图2 TNBC中sTILs呈散在或弥漫分布在肿瘤细胞团的周围间质中：A.PD-L1+sTILs的表达，EnVision两步法；B.CD4+sTILs的表达，EnVision两步法；C.CD8+sTILs的表达，EnVision两步法；D.Foxp3+sTILs的表达，EnVision两步法

2.1.1sTILs中PD-L1表达与TNBC临床病理特征的关系 92例TNBC sTILs中PD-L1阳性20例，阴性72例。将实验所得数据进行χ2检验和相关性分析发现：sTILs中PD-L1表达与TNBC组织学分级、sTILs浸润密度显著相关(P<0.05)，而与肿瘤直径、淋巴结转移、年龄无相关性(P>0.05，表1)。

表1 PD-L1与TNBC临床病理特征的关系

2.1.2sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs与TNBC临床病理特征的关系 sTILs与Ki-67增殖指数呈正相关(rs=0.334，P=0.001)，与组织学分级、肿瘤直径、淋巴结转移、年龄无相关性(P>0.05)。CD4+、CD8+sTILs均与肿瘤直径呈负相关(rs=-0.261，P=0.012；rs=-0.287，P=0.006)，与Ki-67增殖指数呈正相关(rs=0.208，P=0.047；rs=0.286，P=0.006)，与sTILs呈正相关(rs=0.311，P=0.003；rs=0.368，P<0.05)，而与组织学分级、淋巴结的转移及年龄无相关性(P>0.05)。Foxp3+sTILs与组织学分级呈正相关(rs=0.353，P=0.001)，与年龄呈负相关(rs=-0.227，P=0.030)，与患者肿瘤直径、淋巴结转移、Ki-67增殖指数及sTILs无相关性(P>0.05，表2)。

表2 sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs与TNBC临床病理特征的关系

2.2 sTILs中PD-L1表达及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs与TNBC患者预后的关系应用Kaplan-Meier生存曲线及Cox比例风险回归模型对92例TNBC预后相关因子进行单因素和多因素分析。所有患者的治疗方式相同，均为手术辅以相同药物放、化疗，92例TNBC患者均从明确诊断后进行随访，随访时间1～67个月，其中存活80例，死亡12例，平均随访时间31.54个月，其中42例(45.7%)随访时间不满5年，包括出现终点事件(死亡)而终止的病例。PD-L1阳性组20例，其中存活15例，死亡5例，平均生存时间22.60个月；PD-L1阴性组72例，其中存活65例，死亡7例，平均生存时间33.84个月。Kaplan-Meier分析表明：sTILs中PD-L1表达与TNBC患者预后显著相关，与PD-L1阴性患者相比，PD-L1阳性患者的OS更短(P=0.039，图3A)；而淋巴结转移也与较短的OS相关(P=0.012，图3B)。Cox回归分析显示：sTILs中PD-L1表达和淋巴结转移均是OS的独立因素(P<0.05，表3)。sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs在患者预后中的差异无统计学意义(P>0.05，表3)，即与患者预后无相关性。

图3 TNBC sTILs中PD-L1表达(A)、淋巴结转移(B)与患者OS的关系

表3 TNBC患者OS的单变量和多变量分析

3 讨论

TNBC具有高侵袭性和易复发的特点，一般预后较差，而传统的手术治疗辅以放、化疗虽然能够一定程度上提高患者术后的生活质量，但患者病死率仍无明显下降。因此，寻找新的可靠的治疗靶点有助于改善患者的预后及生存率。sTILs作为TNBC的独立预后因素，可以通过其内部免疫亚群，包括CD4+和CD8+sTILs在乳腺癌中发挥主要的抗肿瘤活性，与此同时，研究发现TNBC中PD-L1高表达及Foxp3+Tregs高浸润可能与患者的不良预后有关。然而，对于上述研究在乳腺癌中的预后价值仍然存在争议。本实验通过分析TNBC中sTILs的PD-L1蛋白表达及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs的浸润密度，探讨sTILs及其免疫亚群与TNBC发生、发展的关系，从而进一步揭示肿瘤免疫逃逸的相关机制，为乳腺癌的免疫治疗提供新的靶点和临床依据。

乳腺癌TME中，sTILs在宿主对抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。在一项关于淋巴结阳性乳腺癌的研究中发现高密度的sTILs与高水平的Ki-67相关[12]，另一项乳腺癌的研究亦获得了同样的结论[13]。本实验发现TNBC中高密度的sTILs与高水平的Ki-67呈正相关，这与上述两项研究结果相符合，作者推测sTILs浸润密度的增高与乳腺癌肿瘤细胞的分化和增殖密切相关，这说明sTILs具有重要的抗肿瘤免疫作用。最近一项关于乳腺癌的研究[14]发现：CD8+sTILs与组织学分级及Ki-67增殖指数呈正相关。而本实验发现CD4+、CD8+sTILs均与肿瘤直径呈负相关，而与Ki-67增殖指数呈正相关。CD4+sTILs是一类辅助性T细胞，它可以激活肿瘤特异性CD8+sTILs增殖和记忆，而CD8+sTILs是机体发挥细胞免疫抗肿瘤反应的主要参与者。因此，根据本实验结论可推测，处于高增殖活性的乳腺癌通过与CD8+sTILs相互作用，并使后者产生如γ干扰素等细胞因子，直接或间接促进和增强细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤作用，以实现抗肿瘤免疫反应。而另外一项对88例TNBC活检标本的研究[15]发现CD8+sTILs与临床病理特征无相关性，其原因可能是标本的来源形式(活检标本或手术标本)及储存时间差异等造成实验结果的不同，有待进一步验证。Foxp3+sTILs是一种重要的免疫抑制细胞，它可以通过干扰肿瘤细胞的抗原提呈，抑制T细胞杀伤功能，帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸。Goto等[16]在一项针对TNBC的研究中发现：高水平的Foxp3+sTILs与组织学分级呈正相关，即肿瘤分化越差Foxp3+sTILs浸润越高，这与本实验结果相一致。这提示Foxp3+sTILs可能通过释放TGF-β和IL-10等因子直接或间接抑制肿瘤特异性T细胞发挥免疫抑制功能，促进肿瘤的免疫逃逸，这可能是乳腺癌免疫治疗新的潜在靶点。然而，Glajcar等[17]的研究认为高水平的Foxp3+sTILs与Ki-67增殖指数、肿瘤大小及淋巴结转移相关，这可能与实验标本的类型选择、收集标本数量及免疫组化抗体类型不同相关，有待进一步探索。PD-1/PD-L1是重要的免疫检查点，它可以调节肿瘤细胞和sTILs的功能。尽管关于PD-L1在乳腺癌的研究取得了一定成果，但目前关于sTILs中PD-L1表达及其在乳腺癌中的预后意义仍未得到充分研究。先前的研究发现PD-L1表达与淋巴结转移、Ki-67增殖指数、组织学分级有关[18]。亦有研究表明，PD-L1在sTILs中的表达与患者的不良预后相关[19-20]。本实验使用抗体为PD-L1(SP142)，检测结果显示sTILs中PD-L1表达与组织学分级相关，同时PD-L1阳性患者具有更短的OS，这表明TNBC肿瘤细胞的分化越差，sTILs中PD-L1表达越高，患者的预后越差。

以往大多数实验表明，高水平的sTILs与TNBC患者预后良好相关，即高密度sTILs的TNBC患者具有较长的OS，然而本实验却未能证明该观点，这可能与本组选取的TNBC样本量有限有关，而标本的类型及储存时间、抗体的差异等也可能对实验结果造成影响，有待后续扩充样本数据进行论证。同时本实验发现sTILs中PD-L1表达与TNBC的不良预后相关，sTILs中PD-L1阳性患者较PD-L1阴性患者具有较短的OS。根据本实验结果分析得出，PD-L1高表达可能是TILs介导的抗肿瘤免疫反应的结果，肿瘤细胞通过表达PD-L1与免疫细胞的PD-1结合，抑制免疫细胞的肿瘤杀伤作用，同时也可能通过分泌肿瘤细胞因子直接或间接促进肿瘤的免疫逃逸。有研究认为PD-L1表达与良好的预后之间存在正相关，还有研究发现PD-L1表达与预后之间呈负相关或无相关性[21-22]，这可能是由于不同抗体的敏感性和特异性不同，或肿瘤样本的类型和储存时间以及肿瘤自身异质性等因素造成实验结果的差异。虽然PD-L1表达对患者预后的意义仍有争议，但本实验结果显示PD-L1表达与TNBC的不良预后相关，这更加说明了免疫检查点作用机制在肿瘤进展中的重要作用。本组接下来仍需要纳入更多有关TNBC的临床实验数据，并尽可能的排除干扰因素，以补充TNBC中PD-L1的生存数据对上述结果进行验证。同时，本实验还发现TNBC中淋巴结转移是OS的独立预后因素，淋巴结转移阳性患者较阴性患者具有更短的OS。有研究认为，TNBC中CD8+sTILs可能与患者良好的预后相关，这进一步说明了CD8+sTILs在TNBC中发挥着重要的抗肿瘤免疫反应，同时CD4+sTILs作为辅助性T细胞可以激活肿瘤特异性CD8+sTILs的记忆和增殖，它们共同促进肿瘤细胞的凋亡来实现抗肿瘤免疫反应。然而，本实验未能论证以上观点，有待进一步讨论。最后，本实验通过分析得出Foxp3+sTILs与TNBC患者的预后无相关性，与文献报道结果[5,23]不符，这可能与本组标本及抗体选择的差异有关，需后续进一步研究和分析。

综上所述，sTILs中PD-L1表达及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs浸润程度可能与TNBC的发生、发展密切相关。sTILs中PD-L1高表达提示TNBC患者预后不良，这表明PD-L1可作为TNBC的治疗靶点及预后生物标志物，而由于样本量及抗体选择的差异，sTILs及CD4+、CD8+、Foxp3+sTILs对于患者的预后作用仍有待进一步的研究证实。若能阐明sTILs及其免疫亚群在肿瘤免疫逃逸的相关机制，必将为乳腺癌的免疫治疗提供重大的理论及临床依据。