低共熔溶剂修饰分子印迹聚合物分离刺五加中的刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶1)

李京都 李俊含 刘子晴 胡双羽 马春慧

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

药用植物的绿色提取与高纯度分离一直是我国林木资源高效可持续开发的1个重要研究课题。近年来，我国林源提取物的相关研究与生产均取得迅猛发展，但分离技术创新仍是当前该领域面临的重大挑战。具有选择性识别特点的分子印迹技术近年来在分离植物活性成分、模拟催化反应酶技术、固相萃取、生化传感器、色谱分离等领域显示出很大潜力[1-2]。分子印迹技术(MIT)的原理[3](图1)是通过将官能团的模板及单体进行自组装，再经共聚合过程形成具有特殊结合位点的分子印迹聚合物(MIP)，从而在遇到其他类似结构时，可以高效地、选择性地结合模板分子。这一专属性识别技能可在分离过程中大大提高活性成分的纯度，为后续药物加工活合成提供纯度更高的中间体，降低生产成本，提高经济效益。而低共熔溶剂(DES)由于其低毒性和高生物降解性被用于修饰一些功能化的材料表面或作为致孔剂、修饰剂应用到分子印迹聚合物的合成中，经低共熔溶剂修饰后的分子印迹聚合物的孔状结构分布与大小都有很大改善[4]。因此，本研究尝试以甲基丙烯酸(MAA)和具有高生物相容性的低共熔溶剂作为双功能单体，合成了三分子模板的分子印迹聚合物，并联合固相萃取、技术分离刺五加提取液中刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶3种成分。由于低共熔溶剂的加入不但提高了对模板分子的专属性识别能力及刺五加有效成分的纯度，同时改善了分子印迹聚合物在水相介质中相容性不好的弊端，使吸附在水相中进行。

图1 分子印迹技术原理示意图

低共熔溶剂是Abbott et al.[5]在2003年报道的一种新型绿色溶剂，具有制备简单、价格便宜、生物可降解、能够提高有机反应效率等特点[6-7]。已在分离天然产物的领域应用，如低共熔溶剂对黄芩苷[8]、酚类化合物[9]均表现出良好的提取效果。本研究的目标化合物刺五加苷类及异嗪皮啶由于化学极性相差较大，传统的有机溶剂体系很难同时萃取二者，因此尝试采用同为水相的低共熔溶剂并配合微波辅助法[10]提取刺五加有效成分。不但克服了现有方法——溶剂回流法，加热时间较长，提取效率较低，且所用溶剂量大、毒性较强、污染环境等弊端；还避免了由于操作温度过高，时间加长而破坏其有效成分化学结构[11]。

本研究以东北地区道地药材刺五加(Acanthopanaxsentcosus(Ruper. et Maxim.) Harms)干燥根茎为原料[12-13]，通过微波辅助低共熔溶剂溶液提取刺五加苷B[14-18](紫丁香苷，图2A)、刺五加苷E[19-20](紫丁香树脂酚葡萄糖苷，图2B)、异嗪皮啶[21-22](7-羟基-6,8-二甲基香豆素，图2C)。采用三分子模板的分子印迹技术联合固相萃取技术分离刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶3种目标产物，提高其纯度和回收率。

图2 刺五加苷B(A)、刺五加苷E(B)和异嗪皮啶(C)的化学结构式

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验原料为刺五加干燥根茎，产自黑龙江地区，于2018年10月购自黑龙江省哈尔滨市三棵树药材市场，粉碎至60～80目待用。刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶对照品购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%；聚苯乙烯二乙烯苯树脂微球购自上海樊克生物科技有限公司，纯度为1%；其余试剂均为国产分析纯。

试验仪器及设备为ZNCL-GS(190*90)磁力数显加热锅搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)、XH-100A微波催化合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司)、DZ-1BCⅣ型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、3K-30超速离心机(美国SIGMA公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶的测定方法

本试验采用HPLC法定量测定刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶。精确称取10.0 mg的刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶的标准品放入10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，混合均匀后得到质量浓度为1.0 g·L-1的标准品溶液，作为对照品储备溶液。然后从中取出5 mL的储备溶液放入另一个10 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，制成质量浓度为0.5 g·L-1的标准品溶液，以此类推，分别制出质量浓度为1 000.000 0、500.000 0、250.000 0、125.000 0、62.500 0、31.250 0、15.625 0、7.812 5 mg·L-1的刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶对照品的溶液，用一次性的注射器(5 mL)将配好的标准溶液通过0.22 μm滤膜过滤，保存在1.5 mL的棕色玻璃进样瓶中，进行HPLC检测分析。刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶的检测波长分别为220、206、344 nm。

样品测试与标准品的测试方法相同，用一次性的注射器(5 mL)将样品的提取液通过0.22 μm滤膜过滤，保存在1.5 mL的棕色玻璃进样瓶中，进行测定，分析结束后，记录刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶对应的峰面积，代入标准曲线中求得质量浓度。

1.2.2 低共熔溶剂的制备

试验前将具有强吸水性的氯化胆碱(ChCl)于80 ℃的真空干燥箱内干燥24 h。将氯化胆碱和乙二醇(EG)按一定摩尔比配制，并倒入圆底烧瓶中，80 ℃油浴内磁力搅拌10 min，最终变成无色透明的液体，冷却得到氯化胆碱-乙二醇低共熔溶剂。称氯化胆碱和丙三醇(GI)、氯化胆碱和1,4-丁二醇(BDO)分别制取氯化胆碱-丙三醇、氯化胆碱-1,4-丁二醇低共熔溶剂。在使用前按照含水率加入相应体积的水，以体积比配制低共熔溶剂溶液作为提取液。

1.2.3 微波辅助萃取法

将2.0 g干燥的刺五加原料放入三口烧瓶内，加入20 mL低共熔溶剂(n(氯化胆碱)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化胆碱-乙二醇)∶V(H2O)=5∶5)，放入微波装置中辐射10 min，设定微波功率为400 W，萃取后冷却至室温，过滤，取上层清液，经0.22 μm的滤膜滤入1.5 mL的棕色玻璃进样瓶，液相检测刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶质量浓度，计算得率并在-20 ℃下保存。

1.2.4低共熔溶剂微波辅助萃取刺五加苷B、刺五加苷E和异嗪皮啶单因素试验

按照微波辅助萃取法进行单因素优化试验，确定出最佳的低共熔盐组分及其摩尔比、低共熔溶剂的溶液比和萃取的料液比，然后再对微波的功率及动力学进行研究，确定出最佳的微波功率及微波时间，以刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶的提取率为响应值，得出最优的单因素试验条件。

1.2.5 杂化分子印迹聚合物的合成

称取37.24 mg刺五加苷B，74.27 mg刺五加苷E，22.22 mg异嗪皮啶的标准品置于100 mL具塞锥形瓶中，加入0.042 2 mL甲基丙烯酸(MAA)和0.25 mL低共熔溶剂(n(氯化胆碱)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化胆碱-乙二醇)∶V(H2O)=5∶5)，经10 mL乙腈溶液溶解，再加入1.00 g聚苯乙烯-二乙烯苯(PS-DVB)树脂，超声10 min，使混合物均匀分散并溶解，然后在室温下预聚合2 h；加入17.28 mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)和0.204 2 mL交联剂双甲基丙烯酸乙二醇脂(EDMA)，超声10 min使其混合均匀，通N2除氧20 min，密封处理，放入60 ℃油浴振荡器内，在200 r/min转速下振荡聚合24 h。以甲醇-乙酸为洗脱液，V(甲醇)∶V(乙酸)=80∶20，超声洗脱模板分子及未反应的功能单体、引发剂、交联剂，至无模板物质，再用甲醇洗至中性。于60 ℃真空干燥箱内干燥24 h，制得三模板分子印迹聚合物。用同样的方法制备出相应的无模板聚合物(NIP)。

1.2.6 吸附性实验试验表征

对于静态吸附试验，取50 mg三模板分子印迹聚合物与相应的无模板聚合物，各放进3个试管中，分别向其中加入1.0 mL含有刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的不同质量浓度(100.0、200.0、300.0、400.0、500.0 mg·L-1)的标准液。室温下，将固液混合体系置于振荡器中振摇5 h，而后5 000 r/min离心，取上清液进行液相检测。

对于动态吸附试验，方式同静态吸附试验，但分析物的质量浓度为固定值(刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶均为150.0 mg·L-1)，且在不同的时间(10、20、40、60、80、100、120 min)进行测试。

1.2.7 分子印迹聚合物吸附刺五加提取液

将干燥的刺五加原料按单因素试验中得到的最佳试验条件进行微波辅助提取，得到刺五加提取液。用乙腈复溶，定容至5 mL。分别称取200 mg分子印迹聚合物及无模板聚合物，填充到空的固相萃取(SPE)柱内，两端加入筛板以防止吸附剂流失。填充完制取的填料后，每个固相萃取小柱分别用1.0 mL甲醇溶液和3.0 mL去离子水冲洗柱子。将1.0 mL刺五加提取液流经固相萃取柱，1.0 mL去离子水用作淋洗液，2.0 mL甲醇用作洗脱液，将1.0 mL的注射器置于固相萃取柱的底端，在保证稳定的流速的前提下收集每步冲洗出的液体，收集出的液体用于下一步的HPLC检测。

1.2.8 淋洗液和洗脱液的优化试验

为了得到较高的固相萃取回收率，按固相萃取的方法分别对分子印迹聚合物-固相萃取柱过程中的淋洗液及洗脱液的种类、用量进行优化，进一步考察了固相萃取柱的选择性及可实用性。依次加入1.5 mL甲醇和1.5 mL水对固相萃取柱进行冲洗活化，然后加入1.0 mL刺五加提取液至固相萃取柱。接着加入1.0 mL不同的淋洗液(乙腈；水；乙醇；丙酮；甲醇)到固相萃取柱管中，收集淋洗液，经HPLC计算出损失率，选择淋洗液后再对淋洗液体积进行优化。

选用造成的损失较低的淋洗液进行淋洗，再进行洗脱。分别对5种不同的洗脱液：V(乙腈)∶V(乙酸)=95∶5、V(水)∶V(乙酸)=95∶5、V(乙醇)∶V(乙酸)=95∶5、V(丙酮)∶V(乙酸)=95∶5、V(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5进行对比优化，各取2.0 mL洗脱液加入到固相萃取管柱中，对吸附的目标物进行洗脱，收集固相萃取柱流出液经HPLC计算出回收率，最后对所选出的洗脱液体积进行优化。

2 结果与分析

2.1 HPLC法测定刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶

分别取刺五加苷B(0.125 g·L-1)、刺五加苷E(0.250 g·L-1)、异嗪皮啶(0.250 g·L-1)的标准品储备液进行测定，每次进样5 μL，测定结果见图3，其中刺五加苷B(图3c)的保留时间为3.8 min，刺五加苷E(图3b)的保留时间为7.7 min，异嗪皮啶(图3a)的保留时间为19.2 min。

图3 异嗪皮啶、刺五加苷E、刺五加苷B的标准色谱图

采用同样的测定方法，提取液中的异嗪皮啶、刺五加苷E、苷B的色谱出峰情况分别如图4所示，说明本试验采取的液相条件能够很好的分离本次提取的有效成分。从图中可以看出，刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶依次出峰，所有样品在20 min内出峰完毕。对比标准样品和提取液中的刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的色谱出峰情况，发现提取液中的异嗪皮啶与刺五加苷E出峰时间早于标准品，通过对二者进行内标法，确定图4a中的1号峰和图4b中的2号峰分别为异嗪皮啶、刺五加苷E。

图4 刺五加样品色谱图

2.2 刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶标准曲线测定

用HPLC法检测后，以刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，制作标准曲线，结果见表1。

表1 刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶的标准曲线

2.3 单因素试验

2.3.1 低共熔盐组分的确定

将干燥后的氯化胆碱(氢键受体)与乙二醇、丙三醇、1,4-丁二醇(氢键供体)分别以相同的摩尔比(1∶3)混合后，在80 ℃的油浴内加热10 min，最终获得透明低共熔溶剂。然后，加水以保持V(低共熔溶剂)∶V(H2O)=7∶3。称取1.0 g刺五加原料置于三口烧瓶内，加入制备好的低共熔溶剂，使料液比为m(刺五加根茎粉末)∶V(低共熔溶剂水溶液)=1 g∶10 mL。室温下浸泡2 h，放入微波装置中辐射10 min，设定微波功率为300 W，萃取后进行过滤，并取上层清液，此时溶液呈现淡黄色，冷却后经0.22 μm的滤膜滤入1.5 mL的棕色玻璃进样瓶，液相检测刺五加苷B、苷E及异嗪皮啶的质量浓度，计算得率并在-20 ℃下保存。

结果如表2所示，氯化胆碱和乙二醇混合后对刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的萃取效果均为最佳，因此，选择乙二醇作为氢键供体配制本试验所需的低共熔溶剂。

表2 不同低共熔溶剂对刺五加苷B、苷E和异嗪皮啶提取质量分数的影响

2.3.2 低共熔盐组分摩尔比的优化

氢键供体得以确定后，将氯化胆碱和乙二醇按不同的摩尔比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)混合，在80 ℃的油浴内加热10 min，最终获得透明液体低共熔溶剂。然后，加水以保持V(低共熔溶剂)∶V(H2O)=7∶3。称取1.0 g的原料置于三口烧瓶内，以料液比为m(刺五加根茎粉末)∶V(低共熔溶剂水溶液)=1 g∶10 mL加入制备好的低共熔溶剂，室温下浸泡2 h，放入微波装置中辐射10 min，设定微波功率为300 W，萃取后进行过滤，并取上层清液，溶液呈现出淡黄色，冷却后经0.22 μm的滤膜滤入1.5 mL的棕色玻璃进样瓶，液相检测刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶质量浓度，计算得率并在-20 ℃保存。

检测结果如表3所示，异嗪皮啶及刺五加苷B的提取量随乙二醇比例的增加呈现先增后减的趋势，氯化胆碱与乙二醇摩尔比为1∶3时提取量最高；摩尔比为1∶2时对刺五加苷E的萃取效果最好。综合考虑，选择n(氯化胆碱)∶n(乙二醇)=1∶3为低共熔溶剂的最佳配比。

表3 不同摩尔比的低共熔溶剂对刺五加苷B、苷E和异嗪皮啶提取量的影响

2.3.3 溶液比的优化

将n(氯化胆碱)∶n(乙二醇)=1∶3混合后在80 ℃油浴内加热10 min，获得透明液体低共熔溶剂。然后，加水保持V(低共熔溶剂)∶V(H2O)分别为4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2。称取1.0 g的原料置于三口烧瓶内，以m(刺五加根茎粉末)∶V(低共熔溶剂水溶液)=1 g∶10 mL加入制备好的低共熔溶剂，室温下浸泡2 h，放入微波装置中辐射10 min，设定微波功率为300 W，萃取后进行过滤，并取上层清液，冷却后经0.22 μm的滤膜滤入1.5 mL的棕色玻璃进样瓶，液相检测刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶质量浓度，计算得率并在-20 ℃下保存。

低共熔溶剂是由氢键供体与氢键受体组成，作为溶剂提取天然产物时可提供氢键，增加有效物质的溶出。但由于低共熔溶剂黏度大，湍动性与穿透力均不佳，不能直接作为提取溶剂与物料接触，其会影响植物细胞壁表面的通透性，从而阻碍有效物质的溶出，需要与水配制成溶液而作为提取溶剂。然而，水量的增加导致溶剂化学极性的迅速增加，根据“相似相溶”原理，极性过大对于极性相对较小的刺五加天然产物溶解度有限，所以低共熔溶液中的含水量对于提取结果至关重要。试验结果如图5所示，当低共熔溶剂与水的体积比为5∶5(也就是体积分数为50%)时，刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的提取量均达到最大值，水的加入使溶剂的黏度下降，穿透细胞壁渗透进细胞内部的能力增强，使刺五加苷和异嗪皮啶迅速溶出。而后，刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的提取量随低共熔溶剂与水的体积比的增大而减小，是因为随着水量的加大，溶出的有效成分的溶解能力下降，因而选择V(低共熔溶剂)∶V(H2O)=5∶5为最佳溶液比。

图5 不同溶液比对刺五加苷B、E和异嗪皮啶提取量的影响

2.3.4 料液比的优化

料液比若过大，会增加回收能耗，且浪费溶剂；而料液比较小，则目标成分难以充分且快速的溶出。将1.0 g刺五加原料置于三口烧瓶内，按m(刺五加根茎粉末)∶V(低共熔溶剂水溶液)为1 g∶5 mL、1 g∶10 mL、1 g∶15 mL、1 g∶20 mL、1 g∶25 mL分别加入5、10、15、20、25 mL低共熔溶剂(n(氯化胆碱)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化胆碱-乙二醇)∶V(H2O)=7∶3),室温下浸泡2 h，放入微波装置中辐射10 min，设定微波功率为300 W，萃取过后过滤，取上层清液，冷却后经0.22 μm的滤膜滤入1.5 mL的棕色玻璃进样瓶，液相检测刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶质量浓度，计算得率并在-20 ℃下保存。

经HPLC检测后结果如图6所示，刺五加苷E的质量分数在m(刺五加根茎粉末)∶V(低共熔溶剂水溶液)=1 g∶5 mL时最高，而刺五加苷B、异嗪皮啶的质量分数随料液比的增大逐渐增大；为了降低溶剂黏度，节约试验成本，最终选择m(刺五加根茎粉末)∶V(低共熔溶剂水溶液)=1 g∶10 mL为最佳料液比。

图6 不同料液比对刺五加苷B、E和异嗪皮啶提取质量分数的影响

2.3.5 微波功率与动力学研究

不同的微波功率会影响有效活性成分的提取效率。将1.0 g原料置于三口烧瓶内，分别加入10 mL低共熔溶剂(n(氯化胆碱)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化胆碱-乙二醇)∶V(H2O)=5∶5),室温下浸泡2 h，在不同的微波功率下(300、400、500、600、700 W)萃取10 min，而后过滤取上层清液，冷却后经0.22 μm的滤膜滤入1.5 mL的棕色玻璃进样瓶，液相检测刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶质量分数，计算得率并在-20 ℃下保存。

经HPLC检测后结果如表4所示，400 W微波功率时，对刺五加苷B、异嗪皮啶的萃取效果较好；500 W时，对刺五加苷E的萃取效果较好。之后，各物质的质量浓度随着微波功率的增加而依次减少，为了提高产率并节约试验成本，选择400 W为最优微波功率。

表4 不同微波功率对刺五加苷B、E和异嗪皮啶质量分数的影响

确定出最优功率后，将3.0 g原料置于三口烧瓶内，加入30 mL的低共熔溶剂(n(氯化胆碱)∶n(乙二醇)=1∶3,V(氯化胆碱-乙二醇)∶V(H2O)=5∶5),浸泡2 h，于400 W微波功率下，从第6 min起每隔2 min取样液相检测刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶质量浓度。

经HPLC检测后结果如图7所示，刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的质量分数随着微波时间的增加而提高；10 min后，三者的质量浓度变化趋于平缓。为了提高产率并节约试验成本，选择10 min为最优提取时间。

图7 不同微波时间对刺五加苷B、E和异嗪皮啶提取量的影响

2.4 微波萃取机理分析

图8是刺五加原料在最优单因素条件下提取前后的扫描电镜，从图中可以清晰的看出，提取前(图8A1、图8A2、图8A3)细胞内充满了有效物质，放大至3 000倍(图8A3)时，可以看到许多完整饱满的细胞；提取后(图8B1、图8B2、图8B3)细胞内有效物质明显减少，放大至3 000倍(图8B3)时，细胞内有效物质已被提取完全，提取效果显著。

由此可以得出，微波萃取过程中极高的辐射能造成了细胞由内而外的指数式升温，导致细胞内含有的水分迅速汽化并产生极大压力，过高的压力使得细胞壁损坏，刺五加表面出现裂孔并逐渐增多，其内的有效成分自由流出。因而随着微波功率的增大，各目标成分的萃取质量分数逐渐增加(图8)。由于提取介质的捕获和所含目标成分的质量浓度较低，在整个提取系统中形成了由高到低的质量浓度梯度，因此，各有效物质的萃取质量浓度在微波萃取初期增幅较大。另外，微波辐射还产生了电磁场，加速了刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶分子从固体扩散到固-液界面的速率，从而缩短了各有效物质的提取时间。因此，图8B3中难以看到完整的细胞结构，最终有效物质快速高效地提取出来。

图8 刺五加原料提取前(A1、A2、A3)和提取后(B1、B2、B3)的SEM图

2.5 评估聚合物的吸附性能

为评估分子印迹聚合物、无模板聚合物对3种模板分子的吸附性能，在室温下进行了静态、动态吸附试验。如图9A1、图9B1、图9C1，静态吸附曲线表明了随着标准液质量浓度的增加(5.0～500.0 mg·L-1)，各聚合物对刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的吸附量也有所增加。而分子印迹聚合物相比于无模板聚合物具有更高的吸附曲线，显示出分子印迹聚合物具有更好的亲和吸附能力，这表明3种模板分子均成功印迹到聚合物结构里，且分别在质量浓度为400.0、400.0、300.0 mg·L-1时基本达到吸附平衡。如图9A2、图9B2、图9C2的动态吸附曲线，2种聚合物对3种模板分子的吸附性能不断提高，分别在80、100、100 min时，分子印迹聚合物对3种模板分子的吸附量达到最大值。分子印迹聚合物因存在特殊的印迹位点，吸附性能更好。对于无模板聚合物，不存在对3种模板分子特异性吸附，其只靠少量的物理吸附及非特异性吸附，无模板聚合物对模板分子的吸附量较小，且达到吸附平衡的时间相比较短。

图9 2种分子印迹聚合物对刺五加苷B、E及异嗪皮啶的静态吸附(A1、B1、C1)与动态吸附(A2、B2、C2)

2.6 分子印迹聚合物-固相萃取过程优化

通过测试优化分子印迹聚合物-固相萃取过程中淋洗液和洗脱液的种类、用量，用来更好的纯化3种目标组分并得到较高的回收率。淋洗的作用是去除样品基质中的杂质。通过研究一系列淋洗液(乙腈；水；乙醇；丙酮；甲醇)，结果如表5所示，当加入1.0 mL刺五加提取液，使用1.0 mL淋洗液时，H2O对刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的损失率综合来看最低，分别为10.8%、17.1%、6.9%，因此选择H2O作为淋洗液。为了提高纯化效果以减少损失率，进一步研究了不同体积(0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL)的H2O的淋洗效果。淋洗液体积过少则仍有待测物残留在固相萃取柱中，使得效率降低；体积过多不仅增加了试验所需时间且会造成模板分子损失量较大。如表6所示，淋洗液H2O的体积从1.00 mL增加到1.25 mL,刺五加苷B的损失率由11.1%大幅提高到21.9%，刺五加苷E的损失率由17.7%升至32.2%，而异嗪皮啶的损失率影响不大。结果表明，在保证净化效果的前提下，1.0 mL H2O作为固相萃取淋洗溶剂时，模板分子损失率是可接受的。

表5 淋洗液的种类对刺五加苷B、E和异嗪皮啶损失率的影响

表6 淋洗液的体积对刺五加苷B、E和异嗪皮啶损失率的影响

本研究选用了5种典型的洗脱液V(乙腈)∶V(乙酸)=95∶5、V(水)∶V(乙酸)=95∶5、V(乙醇)∶V(乙酸)=95∶5、V(丙酮)∶V(乙酸)=95∶5、V(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5，其中加入少量乙酸用来破坏分析物的分子间氢键和吸附剂上的识别位点。为降低前一步淋洗造成的损失，使吸附的3种目标组分更有效的洗脱出来，因而先用0.25 mL H2O淋洗，再进行洗脱。如表7所示，当加入1.0 mL刺五加提取液，使用2.0 mL洗脱液时，V(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5相较于其他洗脱液对刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶具有更高的洗脱效率，分别为92.1%、93.6%、87.5%，所以被选用为后续固相萃取的洗脱溶剂。为了进一步增加目标组分的回收率，研究了不同体积(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL)的V(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5的洗脱效果。如表8，观察到体积为2.0 mL甲醇-乙酸洗脱溶剂，洗脱效率趋于稳定，刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的回收率分别为92.8%、94.3%、88.4%，因而选择2.0 mLV(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5作为固相萃取的洗脱溶剂。

表7 洗脱液的种类对刺五加苷B、E和异嗪皮啶回收率的影响

表8 洗脱液的体积对刺五加苷B、E和异嗪皮啶回收率的影响

3 结论

本研究选择东北地区的道地中药材刺五加根茎为原料，以刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶为共同提取对象，采用低共熔溶剂协同微波效应代替传统的乙醇回流，将刺五加中苷B、苷E、异嗪皮啶一同萃取出来，通过单因素分析，得出最佳萃取条件为：氯化胆碱、乙二醇组成的低共熔溶剂，二者摩尔比为1∶3，低共熔溶剂与水的体积比为1∶1，提取料液比为m(刺五加根茎粉末)∶V(低共熔溶剂水溶液)=1 g∶10 mL，微波时间10 min，微波功率400 W。在最佳试验条件下，刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的提取率分别为0.282 0、1.486 0、0.048 5 mg·g-1。以低共熔溶剂与甲基丙烯酸作为双功能单体，合成了三分子模板印迹聚合物，并制备同时富集刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的固相萃取柱。选用1.0 mL H2O作为淋洗溶剂，刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的损失率分别为10.8%、17.1%、6.9%,选择2.0 mLV(甲醇)∶V(乙酸)=95∶5作为洗脱溶剂(此时选用0.25 mL H2O作为淋洗溶剂)，选择性识别3种目标组分，此时刺五加苷B、苷E、异嗪皮啶的回收率分别为92.8%、94.3%、88.4%。本研究为低共熔溶剂微波辅助萃取刺五加中刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶提供了试验数据，并通过对低共熔溶剂用来修饰制备多模板分子印迹聚合物来同时吸附分离目标提取物进行探究，得到了良好的吸附分离结果，从而为分子印迹技术在天然产物萃取方面的应用提供了参考。