儋州市鸭高致病性禽流感免疫效果评估

牟爱生 叶丹 彭维祺 孙卫平 荣光

摘要为了解儋州市鸭高致病性禽流感 H5和 H7亚型二联灭活疫苗的免疫效果，于 2020年 6月在全市12个乡镇养鸭场（户）采集289份血清，采用血凝和血凝抑制试验（ HA-HI ）对禽流感 H5、H7亚型免疫抗体进行检测。结果显示，2020年 6月采集的289份鸭血清样品中，鸭禽流感 H5以及 H7阳性个体数分别为249、203份，免疫抗體合格率分别为 86%、70%，均符合农业农村部要求的免疫抗体水平达到70%的标准。说明 H5和 H7亚型禽流感二联灭活疫苗的免疫效果较好，有较强的保护力。

关键词高致病性禽流感;免疫效果;评估

中图分类号 S852.4        文献标识码 A         DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.013

Evaluation of Immune Effect of Highly Pathogenic Avian Influenza in Ducks in Danzhou， Hainan

MOU Aisheng1    YE Dan2    PENG Weiqi2    SUN Weiping2    RONG Guang2

（1. Danzhou Service Center for Animal Husbandry and Fisheries， Danzhou， Hainan 571700， China;2. Tropical Crops Genetic Re-

sources Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract   In order to understand the immune effect of the subtypes H5 and H7 of highly pathogenic avian influenza in ducks in Danzhou， Hainan， 289 serum samples were collected from duck farms （households） in 12 towns of Danzhou in the spring of 2020. The hemagglutination and hemagglutination inhibition tests （HA-HI） were used to detect the immune antibodies of avian influenza subtypes H5 and H7. The results showed that in the 289 duck serum samples collected in the spring of 2020， there are 249 and 203 duck individuals having positive antibody of avian influenza subtypes H5 and H7， respectively， with 86% and 70% of the duck individuals with qualified immune antibodies against the subtypes H5 and H7， respectively， which are in line with the immune antibody level of upto 70% provided for by the Ministry of Agriculture and Rural Areas. The results showed that the bivalent H5+ H7 avian influenza inactivated vaccine has good immune effect and strong protection.

Keywords   highly pathogenic avian influenza; immune effect; assessment

禽流感（ Avian Influenza， AI ），又称为禽流行性感冒，是由 A 型流感病毒（ Avian  Influenza  Virus， AIV ）引发多种禽类感染的疾病综合征[1]，被世界动物卫生组织（ OIE ）列为 A 类传染病，在我国被列为一类传染病[2-5]。根据对禽类致病性不同，可分为高、低和非致病性3 种类型[6]。其中，高致病性禽流感（Highly  Pathogenic  Avian  Influenza，  HPAI ）H5亚型和 H7亚型，传染性最强，发病率和死亡率最高，造成的疫情程度最重，对家禽和人类危害最严重[7]。因此，接种疫苗以及对家禽进行禽流感的检测是预防和控制禽流感发生的有效措施[8-9]。在高致病禽流感 H5 和 H7免疫过程中，由于场地、母源抗体干扰、操作方法等，往往造成免疫保护不够[9-11]。本研究对儋州市12个乡镇的鸭场随机采样，分离血清，采用血凝（ HA ）和血凝抑制（ HI ）试验方法对鸭禽流感 H5、H7亚型免疫抗体进行检测，并对抗体水平进行分析。客观评价儋州市鸭 H5、H7亚型免疫效果，以期对儋州市鸭禽流感抗体水平有一个正确的认识，对海南省无规定动物疫病示范区和自由贸易港建设具有重要意义。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  主要试剂阿氏（Alsevers）液（自配）; 1%鸡红细胞悬液（自配）;pH 7.2、0.01 mol/L PBS;禽流感病毒 H5亚型（ Re-11株）血凝血抑实验抗原（国生生物，试剂批号：20191106）;禽流感病毒 H7亚型（ Re-2株）血凝血抑实验抗原（国生生物，试剂批号：20191014）。

1.1.2  仪器设备微量移液器;枪头;96孔 V 型微量反应板;微型振荡器;高速离心机;恒温箱。

1.2  方法

1.2.1  样品采集于2020年 6月在儋州市12个镇的养鸭场（户）采集血样289份。采血时，使家禽侧卧保定，展开内侧翅膀，拔除采血部位的部分羽毛，取酒精棉球对采血部位进行消毒，然后将采血器针尖斜口向上，以 30°倾斜插入翅静脉，缓缓抽取血液，达到所需血量后，用酒精棉球按压止血[12-13]。取血样2 000 r/min 离心5～8 min，取上清液于1.5 mL 灭菌离心管中，‒20℃保存备用[14]。

1.2.2  血凝血抑实验（ HA ）

1.2.2.1  血凝实验（ HA ）（1 ）分别吸取0.025 mL PBS 液加到酶标板微孔的1～12孔中，换滴头。

（2 ）吸取病毒悬液0.025 mL 加入至第1 孔混匀，再从第1 孔吸取0.025 mL 加入至第2 孔混匀，如此反复，依次稀释至第11孔，再从第11孔吸取 0.025 mL，弃之，换滴头。

（3 ）每孔分别加入 PBS 0.025 mL、体积分数为 1%的鸡红细胞悬液0.025 mL ，振荡混匀，室温（20～25℃）静置40 min，观察结果。

结果判定∶倾斜反应板，以红细胞无呈泪滴状流淌（完全血凝）的抗原的最高稀释倍数表示一个血凝单位（ HAU ）。本实验的一个血凝单位为256。

1.2.2.2  血凝抑制实验（ HI ）（1 ）根据血凝（HA ）试验结果配制4HAU 的病毒抗原。

（2 ）在微量反应板的1～11孔加入0.025 mL PBS，第12孔加入0.05 mL PBS。

（3 ）吸取0.025 mL 血清加入第1 孔内，充分混匀后吸0.025 mL 于第2 孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.25 mL 弃去。

（4 ）1～11孔为加入含4HAU 混匀的病毒抗原液 0.025 mL，室温（20℃）静置至少30 min。

（5 ）每孔加入0.025 mL 体积分数为1%的鸡红细胞悬液轻轻混匀，静置约40 min （室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行），对照红细胞将呈现纽扣状沉于孔底。

结果判定：以完全抑制4 个 HAU 抗原的血清最高稀释倍数作为 HI 滴度。 HI 价小于或等于3log2判定 HI 试验阴性; HI 价大于4log2为阳性。

2  结果与分析

于2020年 6月检测儋州市12个镇的养鸭场（户）鸭血清289份，抗体检测结果见表1。从表1 可以得出，2020年春季儋州市12个镇的鸭禽流感 H5免疫合格率分别为100%、100%、0、 100%、100%、100%、67%、100%、67%、95%、100%、100%，12个镇中有9 个镇的抗体合格率均达到国家农业农村部的标准（群体抗体水平≥ 70%）。其中，鸭禽流感 H5亚型抗体合格率达到 100%的镇有 A 镇、 B 镇、 D 镇、 E 镇、 F 镇、 H 镇、 K 和 L 镇，达到90%≤抗体合格率<100%的乡镇只有 J 镇，这些地区的抗体水平高，免疫效果显著，表明大多数地区鸭禽流感 H5 亚型的防疫工作受到充分重视，工作落实到位，筑牢了免疫屏障。除此之外， C 镇、 G 镇和 I 镇的抗体水平不达标（群体抗体水平<70%），表明这些地区的防疫工作做得不到位，鸭禽流感 H5 亚型的防疫工作还应进一步扎实。

从表2 可以得出，2020年春季儋州市12個镇的鸭禽流感 H7 免疫合格率分别为100%、 100%、0、100%、100%、70%、67%、3%、100%、100%、95%、0，12个镇中有8 个镇的抗体合格率均达到国家农业农村部的标准（群体抗体水平 ≥70%）。其中，鸭禽流感 H7亚型抗体合格率达到100%的有 A 镇、 B 镇、 D 镇、 E 镇、 I 镇和 J  镇，达到90%≤抗体合格率<100%的乡镇只有 K 镇，这些地区的抗体水平高，免疫效果显著，表明这些地区鸭禽流感 H7 亚型的防疫工作受到充分重视，工作落实到位，筑牢了免疫屏障。在70% ≤抗体合格率<80%的乡镇只有 F 镇，表明 F 镇的抗体水平良好，免疫效果一般，防疫工作要进一步加强，努力做得更好。除此之外， C 镇、 G 镇、 H 镇和 L 镇的抗体水平不达标（群体抗体水平<70%），表明这些地区的防疫工作做得不到位，鸭禽流感 H5亚型的防疫工作还应进一步扎实。

结合表1 、2可知，检测的289份鸭血清中，鸭禽流感 H5、H7 亚型免疫抗体阳性数分别是249、203份，合格率分别是86%、70%，H5、H7亚型免疫抗体合格率均达到国家标准。

3  讨论与结论

从检测结果上看，儋州市鸭禽流感 H5和 H7亚型整体免疫效果良好，免疫抗体合格率均达到了国家标准，表明2020年春季儋州市的鸭总体上已建立起较好的免疫机能屏障，禽流感流行风险较低;但同时地存在少数乡镇禽流感抗体水平较低的现象。造成这种现象的原因可能与鸭群产生抗体时间、疫苗的质量、免疫操作的规范程度、鸭群的饲养环境、鸭机体的健康情况等因素有关[15-18]。

从不同类型鸭禽流感免疫抗体水平上看， H5亚型抗体合格率整体高于 H7 亚型，这与冬春季节的防疫工作落实情况、水禽机体有关，也可能与不同疫苗毒株有不同的免疫原性有关[14，19]。

从检测结果可知，2020年春季儋州市鸭禽流感 H5以及 H7合格率分别是86%、70%，均符合农业农村部要求的标准。说明 H5和 H7亚型禽流感二联苗的免疫效果较好，有较强的保护力。同时，针对抗体水平合格率不达标的乡镇，建议全面排查原因，及时补免，进一步提高免疫抗体合格率，强化免疫屏障。

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（责任编辑林海妹）