热带作物组织器官超低温保存及解冻复苏研究进展

韦秋恩 李志瑛 张大鹏 石鹏 孙熹微 肖勇 王永

摘要植物种质资源是遗传育种的基础，种质资源保存技术研究与应用对维持物种多样性具有重要意义。超低温保存具有保存时间长、节约空间等优点，是一种重要的植物离体保存技术。对热带作物组织器官超低温保存技术的意义、原理、方法以及复苏检测等进行了归纳总结，可为热带作物种质资源离体保存以及生物育种的拓展应用提供参考。

关键词种质资源;热带作物;超低温保存;解冻复苏

中图分类号 S682.31        文献标识码 A         DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.009

Research Progress in Cryopreservation， Thaw and Recovery of Tissues and Organs of Tropical Crops

WEI Qiu’en1    LI Zhiying2，3    ZHANG Dapeng2，3    SHI Peng2，3    SUN Xiwei2，3 XIAO Yong2，3    WANG Yong2，3

（1. College ofHorticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China;2. Coconut Research Institute， Chinese Academy ofTropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China;3. Sanya Research Institute of Chinese Academy of TropicalAgricultural Sciences， Sanya， Hainan 572000， China）

Abstract   Plant germplasm resources are the basis of genetics and breeding， and their conservation is very important for maintaining plant species diversity. Cryopreservation is one of the important in vitro conservation methods and has many ad- vantages， such as long-term storage and little storage space. The significance， principles， method， recovery and detection of cryopreservation of tissues and organs of tropical crops are reviewed， which can provide reference for the in vitro conservation of germplasm resources of tropical crops and their use for biological breeding.

Keywords   germplasm resource; tropical crop; cryopreservation; thaw for recovery

植物種质资源是种业原始创新、现代农业可持续发展的物质基础，是保障国家粮食安全、生态安全和能源安全的战略性资源[1]。在20世纪中叶，世界各国就已开始植物种质资源的收集和保存工作。联合国粮农组织支持和协调国家与地区的遗传资源调查、保存和利用，负责咨询有关提案和设计，利用有限资金保存作物种质资源[2]。中国20世纪50年代起开展了2 次全国性作物种质资源征集，抢救收集了40万份种质资源，但由于缺乏现代化低温库保存设施，约有10万份资源尚未完成抢救保存任务[3]，且目前需要保护的种质资源逐年增加[4]。中国植物种质资源丰富，有三万多种高等植物，特有程度高，是生物区系起源中心之一。在过去的300年中，中国物种灭绝速度被人为地提高了1 000 多倍，物种流失态势不容乐观，大部分栽培作物原产地的野生资源及其近缘种都濒临灭绝[5]。种质资源储藏安全性的需求日益提高，因此，收集和保存种质资源需引起全世界的重视。超低温保存是一种植物种质资源长期安全保存的方法，植物材料可长期保持形态发育的潜能和维持遗传性状稳定[6]。与传统的原位保存相比，超低温保存既可以节省大量的土地资源，又可减少对外界环境的破坏，具有很强的保存稳定性[7]。中国热带面积为50万 m2，约占国土面积的 5%，具有独特的生物多样性和分布地域的不可替代性，是中国生物多样性的重要组成部分[8]。特色热带作物种质资源保存体系尚未健全，建立热带作物种质资源的超低温先进保存技术尤为重要。

1  植物超低温保存的应用与意义

超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存的常用方法之一。在液氮条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，植物体处于一种相对稳定的生物学状态[9]。超低温保存处理时间短，愈伤组织可以在液氮中长期保存，除需定期补充一些液氮，不需要其它仪器和机械设备，可节省大量的人力物力，保存成本相对较低。超低温保存相当于一个低温逆境淘汰的过程，经过超低温保存后复苏再生的愈伤组织抗逆性强，生命力旺盛[10]，可以大大减少甚至终止被保存材料的代谢衰老过程，保持生物材料的稳定性，最大限度地抑制生理代谢强度，达到长期保存种质的目的[9]。研究表明，低温保存可维持冻存材料的遗传稳定性[11]，以冻存后复苏的香蕉胚性细胞悬浮系为材料，对经过体细胞胚发生途径获得的再生植株遗传稳定性进行分析，结果表明，再生植株与对照在形态学方面无明显区别，简单序列重复区间（ ISSR ）分子标记鉴定也未发现显著差异。

有些作物存在自繁带毒的问题，从而影响经济效益，因此脱毒育苗对于相关产业发展具有重要意义。超低温脱毒技术是一种基于超低温保存技术的高效脱毒技术[12]。Helliot等[13]用低温疗法成功地去除了香蕉条斑病毒（ BSV ），脱毒率为90%。该方法被广泛应用于柑橘、番木瓜、香蕉等[14]多种经济作物。并取得了满意的脱毒效果。

2  超低温保存原理

生物体的新陈代谢速度常随着温度的下降而减缓。温度下降至‒196℃时，细胞的生长和酶的代谢活动接近停止，但可保存细胞活力和形态发生的潜能，因而遗传稳定性得以保存，当恢复至合适条件时细胞能够恢复正常状态下的生理功能[15]。新鲜的植物细胞预处理后，在冷冻保护剂的作用下发生质壁分离;细胞外介质结冰，细胞内尚未结冰，胞外冰晶不断增加，在蒸气压差作用下，细胞失水并逐渐变为脱水状态，此种状态能有效阻止细胞质和液泡结冰，当细胞和保护剂间蒸气压达到平衡时，将材料置于液氮，此时细胞质玻璃化，且胞内水分子不发生重组，不产生结构和体积变化，这种玻璃态的水对细胞不构成直接伤害，可保证超低温保存后的细胞活力[16-17]。超低温冻存过程中，对细胞损伤最大的是胞内形成冰晶，因此，应尽量避免胞内冰晶的形成。

3  保存流程

超低温保存的基本过程包括：组织材料的选择→预处理→降温保存→解冻复苏→存活鉴定。比较常用的方法有快冻法、玻璃化法、包埋干燥法等[18]。由于外植体材料的类型、含水量、耐脱水程度及抗冻能力的不同，选择最适的超低温保存方法，是提高超低温保存后遗传材料存活率的关键[19]。

3.1  保存材料的选择

植物材料的基因型不同，超低温保存后存活率一般会存在差异，同时材料的生理状态也会影响超低温保存后的效果[3]。一般来说，超低温保存技术需要选择遗传稳定、再生能力强且成活率较高的材料[5，20]。常见的有种子、花粉、合子胚、茎尖、愈伤组织等。花粉保存常用于不同花期品种的异花授粉，其目的是促进计划育种的杂交，可以在不同地点之间分配和交换种质，以保存种质的核心基因;同时，还可用于基因表达、转化和体外受精的技术研究[21]。茎尖分生组织的分化程度小，在超低温保存后的再生过程中，比其他细胞培养物的遗传性稳定，是超低温保存的一种理想材料，具有独特的优越性。尤其对那些易产生体细胞无性系变异或营养繁殖的植物来说，茎尖分生组织超低温保存是比较理想的保存方案[22]。Ahmore等[23]用番木瓜茎尖进行冷冻保存后，番木瓜基因型的再生率为70%。Abdelnour等[24]对二倍体 AA、BB 型香蕉的合子胚进行了超低温保存，解冻后 AA 、BB 型的存活率分别达到80%、 92%。

3.2  预处理

高渗培养、蔗糖培养、低温培养、 ABA 培养等预处理都可以提高植物对超低温的耐性。高渗培养可通过提高培养基中糖的浓度，添加甘露醇、山梨醇、脱落酸、脯氨酸、二甲基亚砜（ DMSO ）等物质引起细胞脱水[25]，提高分裂相细胞的比例，减少细胞内自由水含量[26]。增加组织中可溶性糖等保护性物质的含量，可避免由于自由水含量高导致细胞内形成大冰晶，使细胞受损[27]。离体材料的适当脱水对提高超低温保存材料的复苏成活率有显著影响[28]。在大多数情况下，将种子水分含量降低到5%～10%就足以抵抗超低温[29]。在预处理中糖浓度的使用颇为重要，它可被视为玻璃化剂，也可用作防冻剂。适当提高糖含量可以有效地降低渗透势，导致水分含量降低，因此糖可以直接发挥脱水或冷冻耐受性的作用，且在细胞中累积不会对细胞造成毒害作用[30]。将椰枣在 0.5 mol/L 蔗糖培养基中预处理48 h 后，使用冷冻剂处理再解冻，再生率为40%[31]。预处理时间与存活率有关，当蔗糖浓度为0.7 mol/L 时，并且将香蕉胚性细胞预处理时间控制在2 d 时，保存效果最好，存活率为76.14%;而随着预处理时间的延长，存活率迅速下降[32]。椰子合子胚在1.75 mol/L 蔗糖预处理下，存活率和发芽率分别为 82%和79%[33]。Hu 等[34]将菠萝茎尖用含有2.0 mol/L 甘油和0.4 mol/L 蔗糖的培养基在25℃下预处理60 min，存活率为100%。用含0.6 mol/L 蔗糖的 MS 培养基预处理山竹茎尖2 d，存活率仅为（13.7±5.5）%[35]。由此可见，根据不同的植物材料的特性，选择合适的预处理方式，使植物材料达到超低温保存的理想生理状态，是提高恢复再生率的有效途径。

3.3  冷冻保护剂的选择

冷冻保护剂能减少超低温保存造成的伤害[36]。因此，选好冷冻保护剂是超低温处理成功的关键。冷冻保护剂具有溶于水、稳定细胞膜结构等特点，能增加膜透性，加速细胞内的水分外渗，保护组织免受冷冻伤害[37]。目前常采用渗透性物质或非渗透性物质的冷冻保护剂，渗透物质包括甘油、乙二醇、二甲基亚砜（ DMSO ）等，非渗透性物质包括蔗糖、甘露醇、聚乙二醇等[38]。添加脯氨酸作为抗氧化剂也能够起到稳定冻存细胞蛋白质结构的作用，复合冷冻剂能充分发挥各种成分的保护作用，从而产生累加作用，但其毒性不累加[38]。用鱼类抗冻蛋白作为超低温保存的保护剂，提高了细胞的成活率，但目前抗冻蛋白基本上都是从极地鱼类提取，价格昂贵，仅适宜于研究和专门的应用，暂时还无法普及[39]。

一般認为， DMSO 是最有效的冷冻保护剂之一。 DMSO 可迅速渗透细胞，降低细胞内细胞液冰点温度，且易透入细胞内部，使细胞在冻融时不会因强烈脱水而损伤[40]。在冻存时处理不同材料所用的 DMSO 浓度不同。在常温下 DMSO 对细胞有轻度药害，但随着温度的降低，药害作用也随之减小[41]。在0℃处理条件下可减轻冷冻保护剂对材料的毒害[42-43]。

PVS2（ MS+30%甘油+15%乙二醇 +15% DMSO+0.4 mol/L 蔗糖）被认为是目前最常用、效果最好的冰冻保护剂，在部分植物中广泛应用。使用玻璃化溶液 PVS2 在0℃处理香蕉茎尖30 min，可以防止细胞质中冰晶的形成[44]，未经 PVS2 处理的材料，保存后茎尖死亡;经30～ 40 min 处理的材料，成活率显著提高，最高达 75.9%;但随处理时间的延长，成活率又迅速下降，其主要原因是 PVS2中 DMSO 的毒害和过度脱水对材料的伤害[45]。不同浓度 PVS2及时间处理的材料获得的成活率差异显著。使用25% PVS2对预培养的香蕉胚性细胞悬浮系进行过渡处理，随着过渡处理时间的延长，细胞相对成活率逐渐提高，处理20 min 时达到最高;不经过渡处理，直接用100% PVS2处理，胚性细胞悬浮系成活率仅为6.3%[11]。Takagi 等[28]比较了几种热带植物对 PVS2的反应，在室温下 PVS2处理10 min 后，所有的香蕉分生组织被杀死。相同材料不同组织对冷冻保护剂的耐受力不同。吴黎明等[45]以广东粉蕉1 号茎尖为材料，结果表明，使用 PVS2处理香蕉茎尖，超低温保存后效果好，而用 PVS3 （ MS+50%甘油+50%蔗糖）处理成活率为0。

冷冻保护剂除了起到保护材料的作用，还可起到提高材料抗耐性的作用。番木瓜茎尖超低温保存过程中，细胞经过预培养、60%  PVS （ MS+22%甘油+13%乙二醇+15% DMSO+13%聚乙二醇）预处理和 PVS 脱水处理后，细胞质壁分离程度逐渐加重，细胞的抗冻力增加[46]。但也有报道认为， PVS3是较好的冷冻保护剂。Sajini等[47]测试了7 种冷冻保护剂的效果，认为 PVS3对冷冻椰子合子胚的萌发最有效，与 Cueto 等[33]研究结果一致。处理时间不同，存活率也不同，用 PVS3溶液对芒果胚性愈伤脱水处理30 min 时，存活率可达到96.7%;处理时间5  min 时，存活率约为80%[48]。由此可见，源于不同物种或不同部位的保存材料所使用的冷冻保护剂不尽相同。

3.4  超低温保存方法

植物材料经过冷冻保护剂处理后，需冷冻在液氮中保存。材料冻害主要发生在冷冻过程中，为了减少冻害，提高存活率，必须尽量阻止细胞内冰晶的形成，避免细胞内结冰，使细胞进入玻璃化状态[49]。因此降温方法是影响超低温保存效果的关键因素之一[26]。目前使用的液氮超低温保存方法主要有快冻法、两步冷冻法、玻璃化法、包埋干燥法、包埋玻璃化法等。不同的冷冻方法各有优缺点，但目前还没有一种方法可适用于所有植物种类和材料，必须根据不同植物材料来确定冷冻方法[50]。

3.4.1  快冻法快冻法是将材料从0℃或其它预处理温度中直接投入液氮内[51]。其原理是利用超速冷冻，促使细胞内的水分迅速从冰晶生成的危险温度区（‒ 140～10℃）降至‒196℃的安全区，使细胞内的水分来不及形成冰晶中心;此时细胞内的水分呈玻璃化状态[36]，该状态对细胞结构不产生破坏作用，从而减轻或避免细胞内结冰危害[52]。此方法一般适用于一些高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎等。黄皮新鲜花粉经28℃干燥处理5～6 h 后，直接投入液氮，解冻后的花粉生活力最高，初步认为黄皮花粉可以在液氮中长期贮存而不显著失去生活力[53]。Panis 等[54]首次用快冻法保存香蕉茎尖分生组织并获得成功，在保存的36个品种中， ABB 基因型香蕉的再生率最高，为 53%，其余基因组型再生率为3.9%～20%。快速冷冻法操作比较简单便捷，但再生率相对较低，不是保存作物种质的最佳选择。

3.4.2  两步冷冻法两步冷冻法结合了慢冻和快冻，先用较慢的速度使材料降至某一温度，用不同浓度的冷冻保护剂处理后，在 24～26℃或4℃下培养1  h，使细胞脱水;然后将细胞冷却到‒40～‒25℃的中低温，在此期间细胞内的保护剂促进冷冻保护剂冻结而不形成冰晶;达到中间温度后，将材料放入液氮进行深度冷冻，以免因细胞外产生非均匀冰晶而对细胞产生严重伤害[44]。1990年， Panis 等[55]利用两步冷冻法保存香蕉胚性悬浮细胞，在 0℃条件下先将悬浮细胞用7.5% DMSO 冰冻保护剂预处理1 h，然后以1℃/min 的慢冻速度降温到‒40℃，再投入液氮中冷冻保存，待香蕉胚性悬浮细胞解冻恢复生长后，经诱导获得再生植株。2009年，赵平娟等[10]研究表明，将橡胶胚性愈伤组织经过‒80℃缓慢降温后再放入液氮中快速降温进行保存，容易恢复愈伤组织增殖能力。3.4.3  玻璃化法 1973年，Luyet等[56]提出玻璃化法。1990年， Sakai 等[57]建立了超低温玻璃化冷冻法，并保存脐橙核心（nucellarcell）细胞，存活率为80%。该法原理是，植物材料经高浓度玻璃化保护液处理后，快速投入液氮中保存，使得保护剂和细胞内水分来不及形成冰晶，从而进入完全玻璃化状态[58]。目前玻璃化冻存法采取完全玻璃化法，即胞内胞外同时为玻璃化状态，可在解冻时均匀化冻。采用该方法对芒果胚性愈伤组织进行保存，化冻后再培养的存活率可高达 100%[37];对香蕉离体茎尖进行保存，平均再生率可达到69%[59];对巴西蕉茎尖进行保存，成活率高达75.9%，再生率为63.4%[60]。傅翠娜[61]建立的菠萝茎尖玻璃化法超低温保存体系，最高可获得96.2%的成活率和93.3%的芽再生率;保存后的茎尖经诱导萌发，其形态上与对照一致，生根后可移栽成活。曾继吾等[62]成功对番木瓜茎尖进行了超低温保存，成活率和再生率分别为53.3% 和51.6%。Suranthran等[63]冷冻保存的油棕多胚状体（polyembryoids）存活率为45%。Gonzalez- Arnao等[64]冷冻了8 个菠萝品种试管苗的茎尖，成活率为10%～65%。与传统超低温法相比，玻璃化法无需昂贵仪器，操作程序简单方便，在植物种质的超低温保存研究中得到了广泛的应用[65]。 3.4.4  包埋干燥法 1990年， Fabre 等[66]首次利用超低温包埋干燥法保存马铃薯茎尖。有研究认为，包埋干燥法可以增强材料对干燥脱水和骤冷的抗性，有利于保存含水量较高的材料[67]。包埋干燥法步骤如下：（ 1）将材料接种于高浓度蔗糖的培养基中脱水;（ 2）无菌空气流或干燥硅胶二次脱水;（3 ）材料嵌入海藻酸盐基质中形成珠子;（ 4）液氮贮存;（ 5）置于水浴中解冻;（ 5）培养再生[68]。Rengeswaari等[69]采用包埋干燥法对油棕多胚状体进行保存，存活率最高为73.3%。N'Nan等[70]用此方法处理保存的椰子胚芽，存活率為60%。2012年，N'Nan等[71]研究出1 种保存椰子合子胚的简易方法，将合子胚接种于含3.2 mol/L 葡萄糖的培养基后，置于含有80 或160 g 硅胶的密封容器中48或 24 h，冷冻保存的胚发芽率为13.7%～74%。可以避免有毒保护剂对材料造成损坏，可应用于对低温保护剂敏感的植物。此外，包埋干燥法相对于其他保存方法有着操作便捷、样本量小、试验成本低等优势，但也存在如脱水需要时间较长、流程较长、容易污染等仍需改进的问题[20]。

3.4.5  包埋玻璃化法包埋玻璃化法是将植物细胞嵌入藻酸盐基质中，可以缓解冷冻和解冻过程中的机械应力和渗透压变化。首先植物细胞悬浮在含有2%海藻酸钠的培养基中，然后滴加到0.1 mol/L  CaCl2 的溶液中，后者诱导交联的海藻酸单体通过静电相互作用，形成海藻酸珠;解冻后，海藻酸珠在培养基中培养几天后破碎并释放细胞[44]。该方法具有能同时处理大量材料、处理后恢复生长快、对材料的毒害作用较小及成芽率高等优点[72-73]。Gamez等[74]对菠萝茎尖的包埋玻璃化法超低温保存处理方法进行了改进，将茎尖包埋在30 g/L 海藻酸钙中，然后用0.16 mol/L 蔗糖+0.3 mol/L 脯氨酸和0.3 mol/L 蔗糖+0.3 mol/L 脯氨酸分别预处理2 d 和24 h，室温下用0.75 mol/L 蔗糖+1 mol/L 甘油的装载液处理25 min，0℃下用 PVS3 脱水60 min 后冷冻保存，品种 MD-2 和Puer-torico的茎尖存活率分别为54%和83%。陈志林等 [72]将木薯茎尖用含有2 mol/L 甘油和0.4 mol/L 蔗糖的装载液处理30～40 min，然后置于含有0.5 mol/L 蔗糖的改良 MS 培养基预培养2 d，0℃下用 PVS2处理4 h，之后快速投入液氮中1 h，取出，放在40℃水浴锅中化冻90 min，用含有1.2 mol/L 蔗糖的 MS 培养液洗涤20 min，接种于恢复培养基中，最高成活率接近70%，再生植株生长和分化正常。该方法同时具备了包埋干燥法与玻璃化法的优点，如操作易掌握、材料恢复生长快等。

3.5  解冻复苏

超低温保存对植物材料产生的伤害往往发生在冷冻和解冻这2 个急速变温的过程中，因此不仅要在降温冷冻过程中选择最合适的方式，而且还要选择合适的解冻方式[50]。处于液氮中的材料若慢慢升温，会使细胞内次生结冰和化冻吸水，对组织细胞造成二次伤害。因此应该在严格控制温度的条件下进行化冻，一般采用37～40℃温水浴解冻[19]。除干冻处理的保存材料外，化冻之后的材料还需要用洗涤液冲洗，减少恢复培养过程中残留冷冻保护剂的毒害作用[75]。Sajini等[47]对椰子合子胚化冻过程中，将冻存管置于40℃条件下水浴解冻2 min ，直到 PVS3 溶解，再用含1.2 mol/L 蔗糖的 Y3液体培养基洗涤1.5 h，共洗涤 3次，复苏培养后，存活率为70%～80%。霍妙娟[76]对贡蕉悬浮细胞进行液氮保存，经 37℃水浴解冻，用含有1.2 mol/L 蔗糖的洗涤液洗涤3 次，每次10 min，细胞生活力最高可达80.46%，后转移到恢复培养基中，通过体细胞胚胎发生途径获得了再生植株。 Ibrahim 等[35]以 MS+0.4 mol/L 蔗糖+2 mol/L 甘油作为洗涤液，山竹茎尖存活率为（ 44.1±6.5）%。

减少再培养中的光抑制有利于离体材料恢复生长。冻存的材料一般需在黑暗或弱光下培养2 周后，再转入正常光照下培养[77]。再培养的培养基有时需将大量元素、琼脂减半或添加 PVP、水解酪蛋白等成分以利于材料的生长恢复[78]。

3.6  存活率鉴定

通常情况下，具有生长和繁殖能力的细胞被认为具有细胞活性，存活率鑒定方法有些建立在细胞活性的基础上。使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红 Y，能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。其中最常用的是台盼蓝染色法，细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的 DNA 结合，使其着色，活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞，通过细胞计数可得出细胞的存活率[79]。虽然台盼蓝染色法操作简单，但细胞计数时间不能太长，否则染料易进入活细胞中，影响计数的准确性[80]。FDA-PI 荧光染色法是基于活性细胞水解荧光素二乙酸酯（ FDA ），得到的荧光素在细胞内累计从而发出绿色荧光，且细胞活性越高，发出的绿色荧光越强[81]。碘化丙啶（ PI ）与细胞内 DNA 和 RNA 物质相互作用生成红色荧光物，使死亡细胞发出红色荧光，通过 FDA-PI 双重荧光染色，在荧光显微镜下，红色与绿色区别明显[80];有些研究则建立在对细胞代谢活性的检测上，例如以细胞还原四唑盐或水解荧光底物的速率表示细胞相对活性的强弱[82]。检测细胞活性的方法很多，各有优缺点和应用价值。

4  展望

目前，超低温保存主要应用于种质资源活体保存。超低温保存的技术方法较多，但应用较多的主要有3 种：两步冷冻法、玻璃化法和包埋干燥法。两步冷冻法需要解决的关键技术是严格控制降温速率;玻璃化法设备简单，冻存组织复苏存活率较高、恢复生长快，操作程序简单方便，但冷冻保护剂中的DMSO 和乙二醇对材料造成毒害作用;包埋干燥法步骤复杂，相对玻璃化法而言，包埋干燥法的优点在于避免使用 DMSO 和乙二醇等对细胞有毒性的冰冻保护剂。包埋玻璃化法结合了玻璃化与包埋干燥的优点，可能会成为今后超低温保存的主流方法。此外，使用蔗糖、山梨糖醇、 DMSO、甘油等冷冻保护剂有助于缓解细胞脱水过程中的细胞损伤，但目前还没有一种能普遍应用于所有植物的方法。为了提高超低温保存材料的存活率，需要做的工作还相当多，如研究更安全的冷冻保护剂和处理方法，探讨低温保护剂的可行性和安全性，优化解冻复苏过程等。

超低温保存在植物生物育种和组培育苗领域应用前景广阔。通过基因编辑和遗传转化开展生物育种是定向培育新品种的发展趋势，对椰子、油棕、槟榔等多年生热带作物而言尤为重要。通过基因编辑和遗传转化创制的新种质或突变体库材料可以愈伤组织的形式进行超低温长期保存，成本低且安全可靠;解冻复苏后可再通过组织培养技术规模化繁育性状一致的组培苗，对于热带作物种苗繁育及新品种试种具有重要应用价值。

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（责任编辑林海妹）