月季粉扇离体快繁技术研究

2022-04-05刘扬李宏杨许惠秋张贻雷梁静萍陈冠铭

热带农业科学 2022年1期

关键词：生根

刘扬李宏杨许惠秋张贻雷梁静萍陈冠铭

摘要為了建立月季粉扇离体快繁技术体系，以月季粉扇的健壮枝条为外植体，研究外植体的消毒、丛生芽诱导、丛生芽增殖、生根壮苗及炼苗移栽，建立一套适合月季粉扇的离体快繁技术体系。结果表明，外植体消毒的最佳方法为 75%的酒精消毒1 min+0.1% HgCl2消毒15 min，培养基添加1 mL/L 山农1 号，污染率为12%，成活率可达74%; WPM+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+山农1 号（外植体型）1 mL/L 丛生芽诱导效果较佳，平均芽数可达2.06，诱芽率为 96%;将诱导出来的丛生芽接种在增殖培养基中进行丛生芽增殖，最佳培养基为 WPM+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ GA32.0 mg/L，接种45 d 增值系数达4.10，诱芽率达100%;将丛生芽切成单株，接种到生根培养基中培养60 d，最终筛选出最佳生根培养基为 WPM+NAA 0.5 mg/L，平均根数达5.0，生根率100%;炼苗移栽至荫棚7 d 成活率为90%，30 d 后移栽到大田的成活率为75%。初步建立月季粉扇离体快繁技术体系，解决了粉扇在三亚地区品种复壮及育苗问题，为月季粉扇的快速繁殖和种质资源保存提供理论和技术支持。

关键词粉扇;离体快繁;丛生芽诱导;生根

中图分类号 S685.12 文献标识码 A DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.01.008

Rapid Propagation ofRosa ‘Fenshan’ Through Tissue Culture

LIU Yang1，3 LI Hongyang1 XU Huiqiu2 ZHANG Yilei2 LIANG Jingping2 CHEN Guanming1

（1. SanyaNafan Academy of Science and Technology， Sanya， Hainan 572000，China;2. Hainan Rose Valley IndustryDevelopment Co.， Ltd.， Sanya， Hainan 572000， China;3. Sanya Academy of Tropical Agricultural Sciences，Sanya， Hainan 572000， China）

Abstract An attempt was made to establish a rapid propagation system for Rosa Fenshan. The stem section of Rosa Fenshan with axillary buds were collected as explants to determine optimum methods for sterilization， induction of shoot cluster， pro- liferation of shoot cluster， test tube rooting， hardening off and transplanting. The results showed that the optimal method for sterilization of the explants is to sterilize the explants with 75% alcohol for 1 min +0.1% HgCl2 for 15min and then add 1 mL·L–1 of Shannong No.1 to the medium， under which the contamination rate is 12% and the survival rate is 74%. The best medium for induction of shoot cluster is WPM +6-BA 0.5 mg·L–1+IBA 0.05 mg·L–1 + Shannong No. 1（type for explant）1 mL·L–1， under which the average number of shoots is upto 2.06， and the shoot induction rate is 96%. The induced clumps of shoots were inoculated on the subculture medium for induction of multiple shoots. The best subculture medium is WPM +6-BA 2.0 mg·L–1+ NAA 0.1 mg·L–1+ GA3 2.0 mg·L–1， under which the multiplication coefficient is as high as 4.10 after 45

days of subculture， and the shoot induction rate is 100%. The shoots were cut from the shoot clumps into individuals， inocu-

lated on the rooting mediums and cultured for 60 days. The best rooting medium is WPM + NAA0.5 mg·L–1， under which the

rooting rate is as higher as 100% with an average root number of 5.0. The rooted plantlets were transferred to culture in a

shade shed for hardening off， and their survival rate is 90% after 7 days of hardening off. After 30 days of hardening off in the

shade shed they are transplanted to the field and their survival rate is 75% after 45 days of transplanting. A rapid in vitro

propagation system is hence initially established for Rosa Fenshan， which might help solve the problem of its rejuvenation and propagation in Sanya， and provide theoretical and technical supports for the rapid propagation of Rosa ‘Fenshan’ and the con- servation of germplasm resources ofRosaFenshan.

Keywords RosaFenshan; fast propagation in vitro; induction of shoot clusters; rooting

月季粉扇（ Rosa fenshan）母本为 Rosa Hiogi，是1999 年南阳月季基地在绯扇月季中发现的芽变品种[1]。花粉色，高心卷边，香型，花朵大、上花率高、单朵花开时间长、适栽范围广，属名贵月季品种[2]。粉扇月季抗白粉病、黑斑病能力很强，属中抗品种，36℃左右的高温对粉扇月季开花略有影响[3]，是一个较耐高温的观赏品种。三亚亚龙湾国际玫瑰谷从云南省花卉技术培训推广中心引种驯化，在园区进行示范种植。因园区长期种植月季，加上三亚高温季节易旱，雨季易涝[4]，土传病害泛滥，品种退化严重，故选择生长健壮无病虫害的粉扇芽点开展离体快繁研究，进行种苗更新换代。现代月季的再生受基因型的影响很大，不同的品种在愈伤诱导、胚状体及芽器官等的发生方面差异很大，且只有少数的品种能获得相对高频率的再生植株。影响月季离体快速繁殖的因素不是单一的，主要影响因素有外植体的选择与灭菌、组培各阶段中的培养基和培养条件选择等[5]。目前国内对月季離体快繁的研究报道很多，如红双喜月季[6]和芳纯月季[7]等。但月季粉扇的离体快繁技术还未见报道。本研究开展了月季粉扇的外植体消毒、初代培养、丛生芽增殖、生根壮苗及炼苗移栽，建立了月季粉扇离体快繁技术体系。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用材料为粉扇健壮带芽点无病虫害枝条（芽点未抽出），2018年 12月采自三亚市亚龙湾国际玫瑰谷月季种质资源圃。其中山农1 号外植体型消毒液购于济南普朗特生物科技有限公司，用于外植体消毒。

1.2 方法

1.2.1 试验设计在连续晴朗3 天以上的上午10点取外植体材料，人工去掉叶片及杂质，剪成1 个芽的茎段，自来水下流水冲洗2 h，加洗洁精摇晃冲洗3 次;然后放入超净工作台，用无菌水冲洗

1次，按照8 个不同处理（表1 ）进行消毒和接种。基础培养基为 WPM 培养基，不添加任何激素。每个处理接种30个外植体，3 次重复，接种14 d 后统计污染率及成活率。成活率是指未污染且发芽的数量占接种外植体数量的百分比。

1.2.2 启动培养启动培养基设6 种（表2 ）： FQ1、FQ2、FQ3、FQ4、FQ5、FQ6，每个处理都添加山农1 号（外植体型）1 mL/L，将带一个饱满芽点的粉扇茎段接种后培养30 d 统计丛生芽诱导率及平均诱导芽数。每个处理15个外植体，3 次重复。

1.2.3 继代增殖继代增殖设置8 个处理： CK 、 FZ1、FZ2、FZ3、FZ4、FZ5、FZ6、FZ7（表3 ），每种培养基接种15个丛生芽，3 次重复。将启动培养获得的健康芽点分离切割成大小一致的单个芽点继续进行丛生芽增殖培养，45 d 后统计增殖系数和诱芽率。

1.2.4 生根壮苗培养选取增殖获得的健壮的大小一致的月季粉扇的芽点，以 WPM 作为基本培养基，选用 NAA 、6-BA 、GA3这 3种激素。3 个激素取3 水平设计组成9 组不同的配方，其中 A（NAA 0.5、1.0、1.5 mg/L）; B（6-BA 0、0.05、0.1 mg/L）; C（ GA30 、1、2 mg/L）。每组接种15棵，3 次重复。接种后观察生根时间，60 d 后统计生根率及平均根数。找出适于月季粉扇组培苗生根壮苗的配方。

1.2.5 粉扇的炼苗移栽与苗圃管理

1.2.5.1 炼苗移栽将生长到6～8 cm 的粉扇生根瓶苗移到有遮阴网的大棚里放置5 d，然后打开盖子再放置2～3 d，出瓶时，洗净根部培养基，用1 000倍的多菌灵浸泡15 min，晾干药液，移栽到提前消毒的基质（河沙∶菜园土∶珍珠岩=1∶3∶ 1，体积比）里。

1.2.5.2 苗圃管理移栽后3 d 左右可喷施1 次1 000倍的多菌灵及低浓度的 NEB;放在通风凉爽的遮阴棚里，3～4 d 喷1 次水，7 d 施1 次叶面肥;30 d 后可搬到大田。

1.2.5.3 月季粉扇炼苗移栽后的田间管理粉扇组培苗炼苗移栽后30 d 可以转移到大田。浇水要遵循见干见湿，不干不浇，浇则浇透的原则。施肥要遵循少量、多次为原则。一般采用充分腐熟的有机肥为主，追施复合肥相结合的方式;病害以白粉病、黑斑病、枯枝病为主，可在发病初期使用500～750倍多菌灵或代森锰锌喷雾，5～7 d 1次，连续2～3次;虫害以蛾类幼虫、蓟马、螨虫为主，采用1 500倍多角体病毒喷雾防治蛾类幼虫，1 000倍吡虫啉溶液喷雾防治蓟马，1 500倍哒螨灵溶液喷雾防治螨虫，间隔7～10 d 1次，连续2～3次。

1.2.6 统计分析试验所得数据选用 SPSS 19.0和 Excel 2003軟件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对月季粉扇成活率的影响

由表4 可以看出，随着75%酒精消毒时间的增加，污染率降低，成活率也随之降低，影响芽的生长，最佳的酒精消毒时间为1 min 。0.1%的 HgCl2消毒10和 15 min 对成活率和污染率影响差异不是很明显。而培养基里添加山农1 号（外植体型）能明显降低污染率，但浓度不宜过大，最适宜的浓度为1 mL/L。用75%的酒精消毒1 min、0.1%的 HgCl2消毒10 min，培养基中添加山农1 号1 mL/L （处理5 ），外植体消毒效果最好，成活率可达80%，污染率为18%;75%的酒精消毒 1 min、0.1%的 HgCl2消毒15 min，培养基中添加山农1 号1 mL/L （处理6 ），成活率可达74%，污染率为12%。处理5 与6 成活率显著高于其他组。

2.2 月季粉扇的丛生芽诱导

外植体接种到启动培养基上10 d 左右开始萌发新芽，最迟14 d 开始萌动。从表5 可以看出，随着6-BA 浓度的增加，平均芽数出现先增加后下降的趋势，在6-BA 浓度为0.5 mg/L 时达到最大。从 FQ3和 FQ4可以看出，相对于 IBA 和 NAA 而言，添加 IBA 粉扇（FQ5）诱芽率显著高于添加 NAA 的FQ4，添加 NAA 的配方，培养周期超过 40 d 就会出现新诱导的芽点慢慢死亡的现象。从诱导的平均芽数来看， FQ3明显优于其他处理，平均萌芽数可达2.06，诱芽率为96%。

2.3 月季粉扇的丛生芽继代增殖

由表6 可以看出，添加一定的激素对月季粉扇有明显的增殖效果。从 FZ1和 FZ4可以看出，在添加 NAA 和 GA3浓度相同的情况下（ FZ1、 FZ4），增殖系数随着6-BA 浓度的增加而提高， 6-BA 浓度为1.0 mg/L 时（ FZ1），会产生生根现象;由 FZ5和 FZ6可以看出，在添加相同浓度6-BA和 AC 的情况下，增值系数和诱芽率随着 IBA 浓度的增大而增大;从 FZ7 可以看出，添加 TDZ 会产生大量的愈伤，但发出的新芽细弱，容易发黄;从生长情况看，未添加 GA3的处理愈伤容易玻璃化，甚至死亡，出芽率极低。从方差分析可以看出，配方 WPM+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+ GA32.0 mg/L（ FZ3）明显优于其他处理，出芽快，增值系数可达4.10，诱芽率为100%。14 d 左右产生愈伤，21 d 发新芽，45 d 左右增殖系数达到最大，然后会出现黄叶现象。60 d 以上部分处理可以长到7 cm 左右，6～7个节，并开始出现黄叶现象。

2.4 月季粉扇的生根壮苗

从表7 可以看出，处理1 和处理7 随着 NAA 浓度的增大生根率和平均根数都有所下降，从平均根数来说，处理1 明显优于其他8 个处理;从处理2 、3、4可以看出，添加低浓度的 NAA 与 GA3配合时可产生大量愈伤，月季粉扇不生根， GA3配合高浓度的 NAA 使用时，产生愈伤，但少量生根;不添加 GA3的处理1 、5、7都没有愈伤，根系也较健康。方差分析结果表明，添加 NAA 0.5 mg/L 的处理月季粉扇生根效果明显优于其他处理，平均根数可达5.0，100%生根，根系健壮，白色。

月季粉扇生根壮苗的培养过程中还发现，培养室的温度不能过高，局部28℃及以上温度超过6 h 以上，粉扇的根系就会从白色慢慢变成黑色，并且停止生长，高温时间过长还会出现黄叶现象。高温造成的停止生长现象恢复极慢，发黑的根系不会再生长，恢复后只能重新萌发新根。

月季粉扇各时期的离体快繁情况见图1。

2.5 炼苗移栽及田间管理

月季粉扇组培苗移栽到大棚后，在三亚冬季7 d 成活率为90%左右，30 d 移栽到大田后的成活率为75%左右;在三亚雨季7 d 成活率为80%左右，30 d 移栽到大田后的成活率为60%左右。一般移栽后7 d 左右会发出新芽，没有发出新芽的会枯萎死亡。

3 讨论与结论

外植体的消毒是建立月季粉扇离体快繁技术体系的关键环节。月季粉扇对75%的酒精处理比较敏感，时间过长，死亡率会明显上升，对 0.1%的 HgCl2反应较迟钝，处理10和 15 min 对死亡率影响不大。闫海霞等[8]研究表明，月季卡罗拉最佳的消毒方案是75%的酒精消毒30 s ，0.1%的 HgCl2消毒10 min，污染率为0;李坤峰等[9]报道月季Vendela外植体最佳消毒处理方式是用洗洁精溶液浸泡30 min，然后用75%的酒精处理40 s ，最后用0.1%的 HgCl2消毒处理10 min 。上述消毒方法与月季粉扇有所差异，本研究表明，无论是哪种处理污染率都没有达到0，消毒最佳的处理也与上述月季有所不同，这可能是因为三亚地处热带，高温高湿时间较长，外植体材料所含微生物种类较多所致，也有可能是取外植体的季节不同导致的差异，具体原因还有待进一步探索。

关于抑菌剂在组培中应用的报到很多，王锋等[10]在进行蛇足石杉组培初代培养时添加了0.05%山农1 号。因粉扇外植体的取材地在三亚，污染率一直较高，故本试验在外植体消毒的启动培养中开展了山农1 号较适浓度试验。试验结果表明，适量添加抑菌剂山农1 号（外植体型）能有效降低污染率，增大成活率，最佳浓度为1 mL/L。

外植体的萌动受到启动培养基成分的影响。刘小夫[11]报道称，丰花月季5 个品系丛生芽最适合的诱导培养基为 MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA2.0 mg/L，诱导率可以达到91.33%～95.56%。刘子平等[6]指出，红双喜最适初代诱导培养基为 MS+6-BA 3.00 mg/L + NAA 0.30 mg/L，诱导率可达到95.56%。笔者在试验过程中发现，对于月季粉扇而言，在配合6-BA 使用时，添加 IBA 培养效果明显优于 NAA，添加 NAA 的配方，培养周期超过 40 d 就会出现新诱导的芽点慢慢死亡的现象，本研究结果与以上学者的结论有所差异，可能不同品种间有所差异。

丛生芽的增殖是组培快繁的重要阶段之一。笔者发现，增殖过程中形成的愈伤如果玻璃化则出芽率就会极低，芽细弱，容易死亡;而添加 GA3的处理，玻璃化会降低，形成的愈伤较少，增殖出的芽较健壮，这与沙琳[12]的研究结果相似。

本研究关于月季粉扇的生根正交试验结果表明，最佳生根培养基为 WPM+0.5 mg/L NAA，平均生根数可达5 条，生根率100%，优于梁崢等[13] 研究结果。在生根培养过程中，温度也是重要影响因素。月季粉扇在生根过程中对温度比较敏感，温度稍微变高，长出来的白色根系就会发黑，停止生长。周庆华等[14]报道指出，月季在生根培养过程中对温度的变化十分敏感，在 21℃时，生根效果最好，这与本试验研究过程中观察到的现象相似。不同月季的品种培养温度不同，是否与月季的耐热性有关还有待进一步研究。

综上，该研究建立了月季粉扇离体快繁技术体系，为月季粉扇的规模化繁殖提供理论基础与技术支持。研究结果表明，月季粉扇最佳的消毒方案为75%的酒精消毒1 min，0.1%的 HgCl2消毒15 min，培养基中添加山农1 号1 mL/L;丛芽诱导培养基为 WPM+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L+山农1 号（外植体型）1 mL/L;最佳继代增殖配方为 WPM+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+GA3 2.0 mg/L;生根效果最好的配方为 WPM+NAA 0.5 mg/L。

参考文献

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