EBV DNA 检测结合Th17、Treg 细胞在小儿EB病毒感染诊断中的应用意义

陈智勇，成胜

盐城市第三人民医院儿科（南京医科大学盐城临床医学院），江苏盐城 224000

EB 病毒（epstein-barr virus, EBV）是儿科常见的感染性病毒，其传播途径广，包括唾液、血液、器官移植等，该病毒具备普遍性、终生潜伏性，难以通过免疫系统进行清除[1-2]。有研究表明，EB 病毒无症状感染多见于幼儿，与鼻咽癌、儿童淋巴瘤疾病发生关系密切[3]。EBV DNA 是检测EB 病毒感染的主要方法，EBV DNA 阳性是其感染最直接证据，但当患者处于恢复期或潜伏感染期，EBV DNA 水平下降，或直接检测为阴性[4-5]。另外EBV DNA 检测方法复杂、成本较高，且当处于潜伏期或缓解期时，会限制其EB 病毒感染的检测[6]。由于自身免疫性疾病常伴免疫系统失衡的问题，辅助性T 细胞17（Th17）/调节性T 细胞（Treg）失衡是致自身免疫性疾病发生的重要机制[7]。但对EB 病毒的免疫特点缺乏系统性研究，且关于EB 病毒感染疾病的免疫学研究的相关报道较少。为了能提高EB 病毒感染检测率，本文选取2020 年1 月—2022 年6 月盐城市第三人民医院儿科收治的50 例EB 病毒感染患儿及同期健康体检儿童50 名作为研究对象，对两组研究对象采用EBV DNA 结合Th17、Treg 细胞检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院儿科收治的EB 病毒感染患儿50 例为观察组，同期健康体检儿童50 名为对照组。观察组中男28 例，女22 例；年龄1～14 岁，平均（6.51±1.02）岁。对照组中男25 名，女25 名；年龄1～14 岁，平均（6.48±1.05）岁。两组患儿一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究已通过医院医学伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：从血清学抗体、骨髓、淋巴结组织等检测出EB 病毒阳性，符合EB 病毒感染标准[8]；病历资料完整；入院前未采用抗感染治疗；参与研究对象的家长或法定监护人知情同意，并已签署同意书。

排除标准：伴免疫性疾病或感染性疾病患儿；伴其他病毒感染患儿；近期经免疫抑制剂或激素类药物治疗患儿；肿瘤性疾病者患儿。

1.3 方法

两组对象均采集空腹静脉血5 mL，分成3 份，分别为1、2、2 mL；EBV DNA 测定：将1 mL 样本添加淋巴细胞1 mL，离心20 min，2 000 r/min，留取中间白色云雾状细胞层，采用荧光定量PCR 法检测，先将细胞层离心5 min，12 000 r/min，留取沉淀物后添加DNA 提取液50 μL，混匀离心10 min，100℃，留取上层清液备用。随后采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增反应处理，条件：93℃，2 min；93℃，45 s；55℃，60 s，总循环10 次。随后93℃，30 s；55℃，45 s，总循环45 次。反应后保存数据，调节荧光值，读取结果，计算待测标本病毒拷贝数，以5×102copies/μL 为临界值，若超过则为阳性。Th17、Treg 细胞：采用流式细胞术测定，Th17 细胞：经密度梯度离心法获取单一核细胞，CO2培养箱内培养5 h，37℃，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline, PBS）洗涤后，丢弃上清液，用FACS CantoⅡ流式细胞仪测定；Treg 细胞：将血清样本加入单克隆抗体后，暗室孵育20 min，添加溶血素1 mL，混匀，离心5 min，1 500 r/min，用FACS CantoⅡ流式细胞仪测定。

1.4 观察指标

①比较观察组和对照组患者EBV DNA 阳性率；②比较观察组和对照组患者EBV DNA、外周血辅助性T 细胞17（T-helper cells, Th17）、调节性T 细胞（regulatory T cells, Treg）水平；③比较观察组中初治组与缓解组EBV DNA 水平外周血Treg 细胞及Th17 细胞百分率水平。

1.5 统计方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以（±s）表示，组间差异比较进行t检验；计数资料以[n(%)]表示，组间差异比较进行χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组组EBV DNA 阳性率比较

观察组EBV DNA 阳性率为88.00%高于对照组的0.00%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 观察组和对照组EBV DNA 阳性率比较[n(%)]

2.2 观察组和对照组EBV DNA、Treg 细胞及Th17细胞水平比较

观察组EBV DNA 含量、Th17 细胞水平均高于对照组，外周血Treg 细胞低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 观察组和对照组EBV DNA、Treg 细胞及Th17 细胞水平比较(±s)

表2 观察组和对照组EBV DNA、Treg 细胞及Th17 细胞水平比较(±s)

2.3 初始组和缓解组EBV DNA、Treg 细胞及Th17细胞百分率水平比较

50 例EB 病毒感染患儿分为初治组16 例，缓解组34 例，初治组EBV DNA 含量、Th17 细胞水平均高于缓解组，外周血Treg 细胞低于缓解组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 初始组和缓解组EBV DNA、Treg 细胞及Th17 细胞百分率水平比较(±s)

表3 初始组和缓解组EBV DNA、Treg 细胞及Th17 细胞百分率水平比较(±s)

3 讨论

EB 病毒属双链DNA 病毒，是传染性单核细胞增多症的病原体，并会诱发鼻咽癌、淋巴瘤等，被证实为可能致癌的人类肿瘤病毒之一[9-10]。EB 病毒感染分为增殖性或潜伏期感染，一旦诱发慢性活动性EB 病毒感染，或相关噬血淋巴组织细胞增生症，病情危重，预后不佳[11-12]。EBV DNA 是检测EB 病毒感染的理想方法，自PCR 技术用于各种病毒抗原检测，明显提高EBV DNA 检测获取率[13]。本研究中观察组EBV DNA 阳性率88.00%高于对照组的0.00%，EBV DNA 含量高于对照组（P＜0.05）。结果表明，EB 病毒感染者存在EBV DNA 含量升高情况，李海霞等[14]研究发现传染性单核细胞增多症患儿EBV DNA 阳性率85.71% 高于健康儿童的3.33%（P＜0.05）。说明根据EBV DNA 阳性检出情况，对判断EB 病毒感染有重要意义。虽然EBV DNA 检测意义较高，但若患儿免疫低下，或使用免疫抑制剂治疗，或病情处于疾病缓解期时，EBV DNA 处于正常，难以获得理想结果。本组研究，初治组EBV DNA 含量高于缓解组（P＜0.05），本研究结果论证了上述研究理论，故需要结合其他指标共同检测。

有研究指出，儿童呼吸系统、免疫系统尚未发育完善，当感染EB 病毒后，极易导致外周血淋巴细胞异常改变[15]。同时病毒感染会释放不同抗原，而此类抗原所产生的抗体起到不同程度的免疫保护机制[16]。Treg 细胞具备免疫调节功能，维持着机体免疫耐受、抑制自身免疫反应的作用。Th17 细胞可以分泌白细胞介素-17（interleukin-17, IL-17）具有抑制病毒微生物侵袭作用之外，也可以促进慢性炎症反应[17]。本研究中，观察组外周血Treg 细胞低于对照组，Th17 细胞水平高于对照组，初治组外周血Treg 细胞低于缓解组，Th17 细胞水平高于缓解组（P＜0.05）。结果说明，EB 病毒感染患儿存在免疫失衡状态，而在缓解期，患儿免疫状态逐渐改善。周洋等[18]研究显示EB 病毒感染患儿存在Treg 细胞减少，Th17 细胞增加现象，在EB 病毒感染的相关疾病发生过程中扮演着重要的角色。分析其原因可能是EB 病毒感染，与EB 病毒靶细胞相关的T 淋巴细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）等功能缺陷，影响EB 病毒清除过程，甚至会促进Th17 细胞分化及发育，使Th17 细胞含量升高，并会出现炎症级别扩大效应，抑制Treg 细胞产生，造成T 淋巴细胞过度活化，从而导致患儿免疫功能障碍。同时当EB 病毒处于裂解期或潜伏期时，特异性毒T 淋巴细胞不断增殖及凋亡，少数免疫抗原隐藏于体内，并在血液内不断循环，若EB 病毒再次增殖，隐藏的免疫抗原会迅速活化，并产生极为明显的免疫应答，致免疫障碍。

综上所述，EB 病毒感染患儿存在EBV DNA 阳性率增加、Th17 细胞升高、Treg 细胞下降情况。因此，采用EBV DNA 结合Th17、Treg 细胞对小儿EB病毒感染诊断及病情评估中具有积极意义。