Xpert MTB/RIF 与改良罗氏比例法药敏试验检测利福平药敏的临床价值

汪芹，纪小亭，黄鑫，曾东晓，秦安东，刘兴祥

淮安市第四人民医院医学检验科，江苏淮安 223001

结核病是通过呼吸道传播的一种传染病，也是世界公认的一种感染性疾病，仍是全球前10 位死因之一。结核病疫情严重[1]，中国位列全球第二，仅次于印度。调查显示，2020 年全球登记的肺结核患者480 万例，其中59%为细菌学确诊病例。2020 年全球诊断的580 万结核病患者中，只有33%（190 万/580 万）使用了分子方法检查（2019 年全球登记结核病710 万）。近年来，由于结核病患者用药不规范，初治或者反复治疗，耐多药结核病（multidrug resistance tuberculosis, MDR-TB）发生率越来越高。目前结核病诊断以及药敏试验的金标准仍是罗氏比例药敏试验检测法，但培养法的阳性率低、时间长[2]，使结核患者未得到及时有效的治疗。利用新技术和更先进的检测设备如Xpert MTB/RIF、宏基因组二代测序[3]、DNA 微阵列[4]等可以及时有效的检测出结核杆菌是否耐药，成为结核病防治工作中当务之急[5]，为临床治疗提供更可靠的治疗依据。因此，本研究选取2019 年7 月—2022 年4 月淮安市第四人民医院246 例肺结核患者作为研究对象，对比Xpert MTB/RIF 和比例法药敏试验检测利福平药敏的临床价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集本院住院或者门诊肺结核患者痰液、肺泡灌洗液、胸水、组织液、脓分泌物、尿液、淋巴穿刺液和脑脊液等经培养结核分枝杆菌为阳性的246 份标本，其 中 女67 例，男179 例；年 龄6～92 岁，平 均（48.8±20.6）岁。

1.2 方法

①改良罗氏比例法药物敏感性试验。将收集的标本经过氢氧化钠处理之后，接种于改良罗氏固体培养基上，常用罗琴培养基，由珠海贝索生物技术公司生产。将培养所得的纯培养菌株作为受试菌株，用于结核杆菌药敏检测[6]，药敏检测步骤和结果报告按照《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》进行。

②Xpert MTB/RIF。结核分枝杆菌rpoB 基因和突变检测（实时荧光PCR 法）试剂盒由美国Cepheid 公司（批号1000272355）生产，Xpert MTB/RIF试验按标准操作步骤进行。GeneXpert 以半巢式实时荧光定量PCR 技术[7]为基础，在结核分枝杆菌特有的序列rpoB 基因上81bp 利福平耐药核心区间（RRDR），专门设计引物和5 条探针，检测该序列是否发生突变，进而判别是否检测到结核分枝杆菌，再检测其对利福平耐药情况。敏感性=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%，特异性=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%。

1.3 统计方法

采用SPSS 20.0 统计学软件处理数据，计数资料以频数和百分率（%）表示，采用χ2检验；一致性计算kappa 值评定。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测利福平药敏结果比较

246 例样本分别经Xpert MTB/RIF 和改良罗氏比例法药敏试验检测利福平的耐药率分别为14.6%（36/246）、11.4%（28/246），差异无统计学意义（χ2=1.15，P＞0.05）。见表1。

表1 Xpert MTB/RIF 和改良罗氏比例法药敏检测利福平药敏结果

2.2 两种方法检测利福平药敏结果符合情况比较

以改良罗氏比例法药敏试验为金标准，Xpert MTB/RIF 检测利福平耐药的敏感性为100.0%（28/28），特异性为96.3%（210/218），符合率96.7%（238/246），两种方法一致性较好（Kappa=0.86）。见表2。

表2 Xpert MTB/RIF 和改良罗氏比例法药敏试验检测利福平药敏符合率对比

2.3 Xpert MTB/RIF 检测利福平基因位点突变分布情况分析

Xpert MTB/RIF 检测的246 份样本中，检测出36例利福平耐药，Xpert MTB/RIF 针对结核分枝杆菌的rpoB81bp 利福平耐药核心区间（RRDR）设计引物及5 条 探 针，包 括ProbeA(507～511)、ProbeB(512～518)、ProbeC(518～523)、ProbeD(523～529)、ProbeE(529～533)，Xpert MTB/RIF 检测利福平耐药位点主要以探针ProbeE（63.9%，23/36）为主，集中在位点529～533 之间，ProbeA 和ProbeB 两个耐药位点同时耐药有2 例。见表3。

表3 Xpert MTB/RIF 检测利福平基因突变情况分析

3 讨论

全球感染结核菌的人群中，绝大部分人感染结核分枝杆菌后因身体抵抗力较高而不会出现明显的症状，即潜伏性结核感染，常用结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test, TST）进行筛查[8]；少数人因免疫低[9]（如艾滋病、糖尿病患者）而出现相应的结核临床症状和病灶，即活动性结核病。我国每年新发结核病人90 万，其中耐多药结核患者约7 万，是高负担结核病国家[10-12]，也是高负担耐多药结核病国家。利福平的单药耐药较少，据调查数据统计分析显示，MDR-TB 患者中约82%为RR-TB 患者，所以利福平耐药结核病（rifampicin resistance tuberculosis,RR-TB）[13]可作为耐多药结核病（MDR-TB）的标志物[14-16]。所以在高科技发展的时代，利用新技术及时有效检测结核分枝杆菌及其利福平耐药性是重中之重。

本研究结果中，比例法药敏试验显示敏感而XpertMTB/RIF 显示耐药有8 例，原因可能是收集的246 例标本中MTB 检测区的基因虽发生突变，但并没有引起耐药表型的改变。有研究指出，主要是因rpoB 基因突变导致结核分枝杆菌耐药，基因突变导致编码RNA 聚合酶异常突变[17]，导致空间构象改变、氨基酸置换，导致利福平耐药。比如，ropB 基因的533、531、526、522、516、513 或511 密码子发生大部分突变，从而使大部分菌株有利福平的耐药性，而密码子507、508、517、521、523 或者532 发生突变的菌株，并不会导致比例法药敏试验检测结核杆菌利福平的耐药性。也有报道，患者感染混合菌株造成不同基因突变，这样使利福平耐药存在差别。

246 例患者标本检测结果中，本研究未出现比例法药敏试验耐药，而XpertMTB/RIF 敏感的病例。据报道，上述药敏情况不符也有可能发生，原因可能为：①MTB 耐药是由其他耐药机制而非基因突变导致的，细菌细胞壁的通透性改变、细菌表达外排泵造成药物的外排等。②MTB 耐药可能由其他基因（非检测区基因）的突变引起的。比如目前用基因法检测inhA 和kaG 基因[18]的突变情况来判断异烟肼是否耐药，据研究发现，因inhA 和kaG 的基因突变产生的耐异烟肼MTB 只占到80%，还有20%可能与其他基因突变有关。

两种方法检测利福平是否耐药可以指导临床合理用药，世界卫生组织在2014 年版《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》中指出利福平药敏试验包括表型药敏试验和基因型药敏试验，任何一个方法发现耐药都需要考虑耐药的可能性，这是由于近年有报道表型药敏试验为敏感，但ropB 基因突变导致耐药，患者采用一线抗结核药物治疗时，治疗结果是失败或复发的，应该使用二线抗结核药物[19-20]。

Xpert MTB/RIF 是一种可以高效、准确地检测结核分枝杆菌和检测利福平耐药性的方法，选择结核分枝杆菌RRDR 作为检测区域，在该序列区域发生突变超过95%，且集中于81bp 的核心区，而敏感株rpoB 核心区序列则基本一致。因此，rpoB 核心区突变能高度提示利福平耐药。另外，由于rpoB 核心区两侧就是结核分枝杆菌特异性基因序列。因此，Xpert MTB/RIF 检测技术给临床提供了快速用药治疗的可能。

综上所述，由于抗结核药的不规范使用或者反复治疗致使结核分枝杆菌容易出现耐多药性，结核分枝杆菌呈现耐多药的菌株在临床肺结核病例中出现比较频繁，给人类带来很大的危害。因此，应该利用现代最先进的分子生物学技术如Xpert MTB/RIF、DNA 微阵列、全基因组（WGS）测序技术等来检测结核杆菌药物敏感性，这样能更及时有效地指导临床合理用药，避免耐药菌株不断的出现。完成2035 年终止结核的目标。相对于传统培养法药物敏感试验检测时间长、操作繁琐等缺陷，XpertMTB/RIF 检测技术具备高灵敏度、高特异性、高集成化、高通量等特性。由于MTB 耐药是由多种机制引起的复杂过程，单纯的耐药基因检测并不能完全反应MTB 的实际耐药情况，所以在实际应用中应综合考虑。