液体培养法与荧光探针PCR 检测阴道分泌物中解脲脲原体的应用价值

王敏，万晓龙

1.江苏省东台市人民医院检验科，江苏东台 224200；2.江苏省东台市人民医院儿科，江苏东台 224200

支原体（mycoplasma）是最小的原核细胞型微生物，无细胞壁，形态多样，可自细菌滤器滤过，生长繁殖于无生命培养基中[1-2]。目前，能够从人体分离出的支原体共有16 种，其中7 种对人体有致病性，以解脲脲原体（ureaplasma urealyticum, UU）、人型支原体（mycoplasma hominis，Mh）最为常见[3-4]。可通过性接触传播，引起人类非淋球菌性和非衣原体性泌尿生殖道感染， 引起妇科疾病与不良妊娠结局[5-6]。目前，对UU 检测临床实验室多采用液体培养基法，可直接检测细菌。另外，还可使用核酸检测的方法检测UU[7-8]。基于此，本文选取江苏省东台市人民医院检验科2019 年1 月—2021 年12 月收治的138 例疑似泌尿生殖道感染者，分别采用液体培养法、荧光探针PCR 法检测，对检测结果进行方法学对比，并探讨联合方式对疾病的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院检验科的138 例疑似泌尿生殖道感染的女性患者，年龄20～58 岁，病程2～12 个月。临床症状：白带增多、混浊、子宫颈水肿、充血或表面糜烂；累及尿道可见尿道口潮红、充血；挤压尿道可见分泌物外溢[9]。本研究所选病例经过医院医学伦理委员会批准，患者或家属知情同意。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：年龄22～50 岁；状态良好，主动配合研究；资料完整，数据真实可靠。

排除标准：重要脏器功能受损者；恶性肿瘤患者；合并其他感染性疾病者；近期有过相关治疗者；妊娠或哺乳期女性。

1.3 方法

所用仪器为ABI 7500 实时荧光定量PCR 分析仪。解脲脲原体核酸检测试剂盒为圣湘生物科技股份有限公司生产。

阴道分泌物检测金标准为Amsel 临床标准[10]，需满足下列4 项中的其中3 项：线索细胞阳性（即数量占阴道上皮细胞总量的20%以上；胺试验阳性；阴道分泌物pH 值＞4.5；阴道分泌物稀薄、灰白色，且质地均匀；必备条件为线索细胞阳性。

以错误分析理论为指导，分析学生的在笔译过程产生的语言错误，教师不仅可以把握学生的英语发展的不同阶段，同时也能认识自身翻译教学过程中的问题。更为重要的是，错误分析有助于检验学生译文的语言知识点、百科知识以及文化知识的不足，这样教师才能及时调整教学模式，学生也能调整自己的学习策略。总之，正如科德指出的那样“错误研究方法，作为是了解语言学习过程中的必要方法，它有助于我们了解语言学习者的语言变化过程，还能反映出我们的学习者处于怎样一个语言学习阶段中”。[17]

1.3.2 液体培养基培养取出所需数量的冷冻干燥培养基，滴加少量稀释液到培养瓶中，充分摇匀至培养基完全溶解。补充滴加稀释液，使液面至标签标线处。在试剂条空白孔中加入50 μl 液体培养基。将采集的样本插入培养基中，挤压旋转拭子数次，使拭子中分泌物洗脱后弃拭子。充分混匀接种后的液体培养基，分别取50 μl 接种到试剂条余下各孔中。在试剂条的每1 孔中滴加1 滴石蜡油，盖上盖子。将剩余培养基连同试剂条放置35～37℃培养箱中孵育。

1.3.1 样本采集所有患者采样前2 h 内不能排尿。采样时，先清洁宫颈口过多的分泌物，将女性用无菌藻酸钙拭子深入宫颈内2～3 cm，用力转1～2 圈后取出拭子。取出的分泌物应略带黏膜，采集后的拭子置入无菌收集管中密封，立即送检。每位患者需取两份阴道分泌物样本。

采用SPSS 22.0 统计学软件处理数据，计数资料以频数与百分比（%）表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

金标准显示：138 例疑似患者中，确诊患者110例；单一诊断方式特异性对比，差异无统计学意义（P＞0.05）；液体培养基培养法灵敏度和准确率高于荧光探针PCR 法，差异有统计学意义（P＜0.05）；与单一诊断方式比较，联合诊断灵敏度、特异度和准确率更高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

综上所述,新生儿护理具有特殊性,而有效的安全护理有助于最大程度消除新生儿临床不安全因素,降低不安全事件的发生率,需要临床重视。

1.4 统计方法

核桃是我国能在国际市场上站稳脚跟的少数农副产品之一，特别是核桃油价格可达66元/kg，加之，核桃生产成本低，投入与产出比是1∶5，核桃果加工成仁能增值0.25倍，加工成油能增值2.5倍，加工成饲料能增值8倍，且收获期长达60多年，产量稳定，所以，核桃产业具有广阔的发展前景。

1.3.3 荧光探针PCR 检测解脲脲原体核酸按照试剂说明书要求，取出试剂盒各组分平衡至室温，混匀后备用；根据待测样本数量，按比例混合反应液、酶混合液和内标配制PCR 混合液，瞬时离心后备用；每孔PCR 反应管中加入核酸释放剂5 μl 后，分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各5 μl；加PCR 混合液40 μl 至每孔后，盖上管盖，2 000 rpm 离心30 s；设置PCR 循环参数进行扩增，PCR 反应条件为：50℃UNG 酶处理2 min，94℃预变性5 min，94℃变性15 s、57℃退火延伸30 s（共45个循环），25℃冷却10 s；测定Ct 值≤38.5，扩增曲线呈典型S 型，同时内标Ct值≤40，为解脲支原体阳性。

液体培养基培养法报告获取时间为（47.78±2.16）h，明显长于荧光探针PCR 法的(25.12±1.44）h，差异有统计学意义（t=102.540，P＜0.001）。

2 结果

2.1 液体培养基培养和荧光探针PCR 两种检测方法结果的比较

以Amsel 临床诊断标准为金标准，液体培养基培养法对UU 的检出率为76.09%，高于荧光探针PCR 法的57.25%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两种检测方法结果的比较

2.2 单一检测与联合检测的诊断价值比较

当有解脲脲原体生长时，24 h 观察培养基由黄色变成红色；当有人型支原体生长时，48 h 观察培养基由黄色变成红色。空白孔阴性表示试验结果有效，可对其余各孔结果予以判定；空白孔阳性表示试验过程中有污染，结果无效。

表2 单检测与联合检测的诊断价值比较

2.3 两种检测方法报告获取时间比较

2.3.1 HCC 结果(表2、表3)显示：388例HCC患者中，肿瘤大小、肿瘤数目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦与否)是影响术后总体生存的独立因素(P<0.05)；肿瘤数目、γ-GGT水平、肝硬化、血管侵犯、BMI(消瘦与否)是影响术后复发的独立因素(P<0.05)。

3 讨论

本研究中荧光探针PCR 法解脲脲原体的检出率为57.25%，低于液体培养法的76.09%，差异有统计学意义（P＜0.05）。造成检出率差异的原因可能为：①解脲支原体的两个亚型微小脲原体（ureaplasma parvum, Up）与解脲脲原体都能分解尿素，使培养酚红指示剂变红，因此液体培养法无法区分[11]。②液体培养基中所含抗菌药物不能完全抑制阴道分泌物中复杂多样的微生物，也可造成假阳性。③液体培养基法通过检验人员的肉眼判读结果，易出现主观因素导致的随机误差[12-13]。而荧光探针PCR 法可针对UU 设计特异性引物进行单项检测，假阳性概率较低。除具有较强的特异性之外，荧光探针PCR 法还有较高的敏感性，最低检出量仅为400 copies/mL；检测时间短，只需数小时便可完成；污染率低，仅需加样时开盖，全封闭状态操作等方法学的优点，是目前临床实验室广为应用的一种新型病原微生物检测技术[14]。

北方的冬天，有着纯洁的美。夜间下雪时，我总爱站在街灯下，头向上仰望着，眼睛努力睁大，看着被灯光折射过的飞雪，雪花调皮地打在脸上，有些渗入衣服里，一阵冰凉的感觉传来，可我却感觉不到冷。路上的行人很少，雪地上只有一些稀稀疏疏的脚印，也许是因为都不忍心破坏这纯洁无暇的美丽风景吧。眼前的路是一片洁白，似乎已经铺上了一条白地毯。雪花不时地飘到我的脸上，抬头望去，每一片飞舞的雪花，在灯光的映射下，仿佛就是一簇簇从天上洒下来的银屑。

传统的液体培养法虽然方法学特异性不如荧光探针PCR 法，但其所检测的只能是阴道分泌物标本中的活体支原体，可为疾病准确诊断以及疗效跟踪观察提供实验基础。与此同时，该检测方法操作相对简单，还可检测人型支原体，也是临床实验室不可或缺的解脲脲原体检测手段[15]。学者冯米妹等[16]在研究中发现，液体培养法的检出率为90.28%,明显高于PCR 法的77.78%（P＜0.05），与文中结果一致。

文中对比联合方式对疾病的诊断价值，结果显示液体培养基培养法联合荧光探针PCR 法对疾病的诊断灵敏度、特异度和准确率高于单一诊断方式（P＜0.05），由此可见，解脲脲原体感染时，只选择一种检测方法有一定的局限性，而联合传统的液体培养法和荧光探针PCR 法两种方法同时检测，快速准确地鉴定解脲脲原体，也可在此基础上准确诊断疾病，还能够为疗效监测提供依据，优势互补更有利于指导临床UU 感染的诊断和治疗[17-18]。两组报告获取时间对比结果显示，荧光探针PCR 时间更短（P＜0.05），24 h 左右即可获得检测结果，可为疾病早期诊断提供更为可靠的依据，便于疾病治疗工作尽早开展，缓解患者压力。

综上所述，液体培养基培养法和荧光探针PCR均可用于解脲脲原体感染诊断，二者联合，可进一 步提高诊断价值。