分散固相萃取-气质联用法快速测定蜂蜜中112种农药残留

郑剑峰， 董叶箐， 俞婕， 钟寒辉， 韦栋屹， 虞祖苗， 孙文闪

(绿城农科检测技术有限公司，浙江 杭州 310051)

蜂蜜是一种纯天然的滋养食品，富含果糖、葡萄糖、维生素、氨基酸、矿物质、生物酶等营养成分，具有增强免疫力、杀菌、保护肝脏、促进胃肠蠕动以及改善睡眠等保健功能，在食品行业得到广泛的应用，然而蜂农不恰当地使用农药和蜜蜂采集被农药污染的花粉，可能导致农药在蜂蜜中残留甚至超标。研究表明，世界上超过75%的蜂蜜存在农药残留[1]。我国是蜂蜜养殖大国，每年蜂蜜总产量超50万t，占世界蜂蜜总产量的1/4以上[2]，同时蜂蜜也是我国的传统出口商品之一，日本、美国和欧盟等国家和地区都对蜂蜜中的有机磷和菊酯类农药制定了最大残留限量，并且不断对蜂蜜农药残留标准、规则进行调整[3]。作为蜂蜜出口大国，我国也出台了蜂蜜相关检测标准及蜂蜜中农药最大残留限量标准。加强对蜂蜜中农药残留的检测具有重要的现实意义，既可以保护人们的身体健康，又有利于蜂蜜的出口贸易。因此，建立一种简单、快速、灵敏、准确的蜂蜜中多种农药残留的检测方法，对于保障人民舌尖上的安全非常重要。

目前，蜂蜜中农药残留的分析方法有气相色谱法[4-5]、气质联用法[6-7]和液质联用法[8-12]。气相色谱法分析时间长，选择性差且易出现假阳性；液相色谱-质谱法分析时间短，选择性强，但是大部分脂溶性农药在液质上响应低或者无响应，前处理的净化方法主要有固相萃取净化和分散固相萃取净化，固相萃取净化法存在有机试剂消耗量大、时间长、效率低、成本高等缺点。分散固相萃取净化法[13-16]由于其简单、可靠、快速、经济的优点在蔬菜水果农药多残留的检测中大量应用，而在蜂蜜样品多农药残留前处理应用的研究相对较少。本文通过对分散固相萃取净化的前处理和仪器条件的优化建立了可以快速检测蜂蜜中112种农药残留的方法，该方法具有操作简单、分析时间短、抗干扰能力强、灵敏度和准确度高等优点，为蜂蜜中多农药残留分析提供了快速的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

蜂蜜样品从超市购买。

Agilent 7890B/7000C气相色谱-串联质谱仪、HP-5MS色谱柱(20 m×0.25 mm，0.25 μm，美国Agilent公司)；ST16R 离心机(美国赛默飞世尔公司)；BSA2202S电子天平(德国赛多利斯公司)；漩涡混合器(TALBOYS)；KQ5200E超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；Reeko AutoEVA-20全自动氮吹浓缩仪(杭州博睿科仪器有限公司)。

克百威、2,4-二甲基苯胺、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、特丁硫磷、乐果、δ-六六六、灭线磷等112种标准品(纯度>98.0%)购自德国DnEhrensmUerGmUH公司；内标外环氧七氯(纯度99.5%)购自德国DnEhrensmUerGmUH公司；乙腈、丙酮、甲醇(色谱纯)购自美国Merck公司；N-丙基乙二胺 (N-propylethylenediamine，PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、0.22 μm聚四氟乙烯滤膜购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；氯化钠、无水硫酸镁(分析纯)购自广州化学试剂厂，无水硫酸镁使用前需在马弗炉中550 ℃烘干4 h。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

HP-5MS色谱柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)与空心柱串联(5 m×0.25 mm)，进样口温度280 ℃，柱流量1.4 mL·min-1；采用程序升温：起始柱温80 ℃，保持0 min，以40 ℃·min-1升温至160 ℃，保持0 min，再以20 ℃·min-1升温至290 ℃保持1.5 min，总用时12.0 min；进样量2 μL，不分流进样，载气为高纯氦气，碰撞气为高纯氩气，纯度≥99.999%。

1.2.2 质谱条件

电离方式为EI；色谱-质谱接口温度为280 ℃；电离能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；检测器电压为1 798 V；数据采集为多重反应监测；定量方式为内标法；112种农药的质谱参数见表1。

表1 112种农药的GC-MS/MS分析参数

表1(续)

1.3 样品前处理

1.3.1 样品提取

称取蜂蜜样品(2.50±0.01)g于50 mL离心管中，加入8 mL一级水，2 500 r·min-1涡旋振荡1 min，再加入15 mL乙腈，2 500 r·min-1涡旋振荡1 min，超声提取20 min后，加入5.0 g氯化钠、2.00 g无水硫酸镁，2 500 r·min-1涡旋振荡1 min，8 000 r·min-1离心3 min，上清液待净化。

1.3.2 净化

取1.3.1待净化液8 mL至15 mL离心管中，加入0.10 g C18、0.20 g PSA、0.50 g无水硫酸镁，2 500 r·min-1涡旋振荡1 min，8 000 r·min-1离心3 min，取出6.00 mL置于10 mL刻度管中，40 ℃氮吹至近干，准确加入1.0 mg·L-1外环氧七氯100 μL，再准确加入900 μL正己烷，2 200 r·min-1涡旋30 s，超声30 s，过0.22 μm有机滤膜，待上机。

1.4 标准溶液的配制

分别准确称取一定质量各农药及内标外环氧七氯，用正己烷溶解，定容至50 mL容量瓶中，分别配制成500 mg·L-1的标准储备溶液，于4 ℃冰箱避光保存；分别准确移取0.50 mL标准储备液，用正己烷稀释定容于100 mL容量瓶中，配制成2.5 mg·L-1混标标准中间液。准确移取0.50 mL内标储备液稀释到50 mL容量瓶中，得到5.0 mg·L-1内标中间液，于4 ℃冰箱避光保存。取蜂蜜空白样品经过1.3.1提取和1.3.2净化后的基质溶液配制0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.50 mg·L-1基质混合标准曲线。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

蜂蜜样品因其黏稠度大，直接加入试剂进行提取效果较差，而蜂蜜的主要成分为果糖和葡萄糖等糖类，因此，可以加入纯水进行溶解稀释来降低黏稠度，然后再加入提取剂进行萃取，来改善提取效果，当样品量为2.50 g时，比较加入不同体积(4、6、8、10、12 mL)纯水对提取回收率的影响，试验发现当纯水的加入体积为8 mL时，提取回收率已达到稳定值，因此，加入纯水的最佳体积为8 mL。当蜂蜜的样品量为2.50 g，加入纯水体积为8 mL时，比较甲醇、乙腈、丙酮3种溶剂对蜂蜜样品中112种农药组分提取的效果(加标浓度为0.5 mg·kg-1，n=6)。当采用甲醇提取时，由于极性较强，甲醇与水难以通过盐析分层，提取回收率较差。而采用乙腈和丙酮提取时，农药组分有较好的溶解性，加入氯化钠和无水硫酸镁后，丙酮、乙腈与水容易分层，提取回收率比较理想，分别达到了82.1%～103%和81.6%～105%。但是丙酮为易制毒试剂，采购领用等程序比较繁琐，因此，选取乙腈作为提取溶剂。

2.1.2 提取剂体积的优化

当蜂蜜的样品量为2.50 g，加入纯水体积为8 mL时，比较不同体积(6、10、12、15、20 mL)乙腈的提取效果(加标浓度为0.5 mg·kg-1，n=6)，以回收率作为考察指标，试验结果表明，回收率随着提取体积的增加而升高，当体积增加到15 mL时，回收率已达到稳定，为了避免有机试剂的浪费以及可能对环境造成的污染，选择乙腈的提取体积为15 mL。

2.1.3 提取时间的优化

提取溶剂和体积确定了以后，需要对提取时间进行优化，本研究比较不同超声时间(10、15、20、25、30 min)的提取效果(加标浓度为0.5 mg·kg-1，n=6)，以提取回收率作为考察指标，结果表明，提取回收率随着超声时间的增加而升高，当超声时间达到20 min之后，回收率无明显的提高，因此，最佳的超声时间为20 min。

2.1.4 净化方法的选择和优化

蜂蜜样品经过水-乙腈提取盐析分层，农药组分被分配到乙腈层中，而部分糖类和大部分有机色素也会溶解在乙腈层，这些物质的存在会对上机测定产生干扰，进而影响检测结果的准确性，因此，需要对提取液进行净化，提高检测结果的准确性。农药残留常用的净化方法为固相萃取净化和分散固相萃取净化，固相萃取净化成本高、效率低、有机试剂消耗量大，与固相萃取净化相比，分散固相萃取净化简单、可靠、快速、经济，常用的净化剂为PSA、C18和无水硫酸镁。其中无水硫酸镁的作用主要是除去提取液的水分，经过试验比较，0.5 g可以将水分去除。而PSA和C18可以去除糖类和色素等物质，本研究比较了PSA、C18不同用量组合对净化效果和回收率的影响，结果表明，当0.1 g C18和0.2 g PSA组合时的回收率最好，净化粉用量过低时，杂质去除效果较差；净化粉用量过高时，部分农药组分被PSA吸附，导致回收率低。因此，采用0.1 g C18、0.2 g PSA和0.5 g无水硫酸镁组合净化。

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 质谱条件的优化

在电子轰击离子源(EI)电离模式下对112种农药组分进行一级质谱扫描(Q1 Scan)，分别找到各个化合物的母离子，在3～45 eV进行碰撞能量的优化，对选定的母离子峰进行子离子扫描，根据子离子扫描质谱图，选择离子强度最大的为定量离子，离子强度次之的为定性离子。112种农药化合物优化后的离子对和碰撞能量参数见表1。

2.2.2 气相条件的优化

通常情况下，气相色谱-质谱完成112种农药组分的分离需要80 min以上，本研究采用三重四级杆质谱的多重反应监测模式，在该模式下，离子对扫描具有高选择性和特异性，采用HP-5MS色谱柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)，分离结合升温程序的优化，实现了12 min内完成112种农药分析，同时为了避免色谱柱进口端的污染，在色谱柱进口端与空心柱串联(5 m×0.25 mm)，而不影响分析时间。

2.3 方法的线性范围、检出限及定量限

检出限和定量限通过空白样品加标回收试验获得，进样分析信噪比(≥3)和(≥10)对应的样品中浓度。经过试验条件优化，112种农药组分的检出限为0.002 mg·kg-1，定量限为0.005 mg·kg-1。对0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.500 mg·kg-1系列浓度的混合标准基质溶液进样分析，进行线性拟合，相关系数均>0.995，112种农药组分在0.005～0.500 mg·kg-1线性关系良好。

2.4 方法的准确度和精密度

方法的准确度通过空白蜂蜜样品添加回收率来分析，精密度通过同一浓度添加6次回收率的相对标准偏差获得，添加浓度选择高中低(0.450、0.050、0.005 mg·kg-1)3档浓度，从表2可以看出，本方法回收率和精密度符合GB/T 27404—2008食品理化分析方法确认的要求。

2.5 样品基质效应的考察

基质效应指待测目标物的样品提取物，会增强或抑制被测目标物的检测响应，从而对检测结果的准确度造成影响，气相色谱-质谱方法的建立需要考虑基质效应对准确度的影响。本研究采用基质标准曲线结合内标法定量来消除蜂蜜基质效应对定量分析的影响，112种农药组分的空白添加回收率在68.4%～102%，说明该方法可以有效地消除蜂蜜样品的基质效应，适应于蜂蜜样品中112种农药残留的测定。

表2 蜂蜜回收率和精密度(n=6)

3 小结与讨论

本研究通过对样品前处理和仪器条件的优化建立了分散固相萃取-气相色谱串联质谱内标法同时检测蜂蜜中112种农药残留的方法，该方法操作简单，色谱分离采用HP-5MS色谱柱(20 m×0.25 mm×0.25 μm)与空心柱(5 m×0.25 mm)串联，12 min内完成112种农药分析，进样时间短，多重反应监测内标法定量，抗干扰能力强，灵敏度和准确度高，为蜂蜜中多农药残留分析提供快速的检测方法。