风车草对人工湿地基质微生物多样性的影响

2022-04-01周俊威王强强蔡贤雷邓欢欢李淑娟葛利云

浙江农业科学 2022年4期

周俊威，王强强，蔡贤雷,3,4，邓欢欢,3,4，李淑娟，葛利云,3,4*

(1.温州医科大学公共卫生与管理学院,浙江温州 325035； 2.浙江中蓝环境科技有限公司,浙江温州 325000；3.浙南水科学研究院,浙江温州 325035； 4.温州医科大学浙江省流域水环境与健康风险研究重点实验室,浙江温州 325035)

湿地是一种过渡性地带，处于陆生生态和水生生态两种系统之间[1]。而人工湿地则是指通过人为手段建造的、可以调节的工程化湿地系统[2], 因其具有调节生态、效果可靠、环境友好等优点，被广泛应用于水质净化领域。

人工湿地根据运行中不同的水力方式，分为表面流人工湿地、垂直潜流人工湿地和水平潜流人工湿地。表面流人工湿地存在占地面积大、水力负荷小、处理能力弱、夏季易滋生蚊虫等缺点[3]。垂直潜流人工湿地的水质净化能力在这三种类型的人工湿地中是最强的，但是污水的水力流程较短，反硝化作用较弱，且建造成本高、运行管理复杂[4]。水平潜流人工湿地则拥有水力和污染物负荷大、处理效果好、造价及管理难度适中等优点。

湿地里的植物主要起固定基质表面、提供良好过滤条件、防止湿地堵塞和为微生物提供良好根部环境等功能[5]。在我国南方地区,湿地植物选择范围大,美人蕉、再力花等很多常见植物在富营养化治理生态工程中都有被应用[6],张韵[7]通过黄菖蒲、石菖蒲、梭鱼草、再力花、美人蕉和风车草这6种湿地植物对受污染水体净化能力的对比研究发现, 风车草生长快速、耐寒性好且去除率最高，更适合用于水污染治理。因此，本研究选取风车草做为实验植物。

综合考虑后本次实验以人工水平潜流湿地作为研究对象，比较种植风车草和未种植风车草对人工湿地砾石表面基质微生物的影响。由于被采集样品所处环境的不同，各组别间的微生物种类和组成可能存在部分差异[8]。微生物群落的不同也许会影响人工湿地的净化过程，从而导致不同的净化表现。实验中运用高通量测序技术对细菌16S rDNA基因进行扩增并测序，比对不同人工湿地环境下微生物的多样性，研究其菌群结构和优势菌种，挑选出合适的人工湿地类型，并为今后的人工湿地方案设计提供参考。

1 材料与方法

1.1 处理与样品采集

人工水平潜流湿地由PVC板搭建而成，内部填充砾石(直径4～6 mm)构成填料基质。风车草的种植密度约为25株每平方米，该设备已运行3 a以上[9]。依照随机均衡的原则，在人工湿地选取4个采样点，采集样品为砾石表面基质，同时依据是否种植风车草分别建组，将未种植风车草的人工湿地组命名为B组，样品名为B1、B3、B7、B9，将种植风车草的人工湿地组命名为C组，样品名为C1、C3、C7、C9。

1.2 样品分析

取1 g样本，采用DNA 提取试剂盒(OMEGA E.Z.N.A.®Soil DNA Kit)根据使用说明进行DNA提取，同时利用微型荧光计(Turner Biosystems,TBS380) 结合DNA检测试剂盒(Solarbio，PicoGreen)检测提取 DNA 的浓度和纯度。然后根据浓度检测结果，采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 样品的完整性，电压为 120 V，电泳时间约为 20 min。

选用16S rRNA V4 可变区的通用引物进行扩增，引物分别为563F (5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和802R (5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)，94 ℃预变性4 min，变性30 s，50 ℃退火30 s，循环25次，72 ℃延伸30 s，72 ℃最终延伸5 min，10 ℃终止保存。扩增结果用凝胶回收试剂盒来回收片段，委托上海派森诺生物科技有限公司进行Illumina高通量测序。

在派森诺平台上用Flash[10]软件进行质控，利用QIIME2[11]软件过滤、拼接和去除嵌合体；利用RDP-classifier[12]贝叶斯算法对0.97[13]相似水平的OTU代表序列进行分类学分析；最后根据样品OTU数据计算α多样性获得相关指数。

1.3 数据分析

利用STAMP[14]软件采用Welch’s t-test进行2个组别间的统计检验，并绘制Extended error bar误差线图，分析各分类水平下组间的差异显著性；用Excel软件对B组和C组的多样性指数进行单因素方差分析；用Past[15]软件在OTU水平利用UPGMA算法采用Bray-Curtis作为相似性测度进行聚类分析，并通过ANOSIM分析检测B组和C组的相似性。

2 结果与分析

2.1 α多样性

在0.97分类水平上，基质样品的α-多样性指数如表1所示。所采集的全部样品的微生物覆盖率均大于94%，表明样本内基因序列被检出的概率很高，测序结果可靠，可以用来准确地反映样品的情况。

表1 B组和C组样品的多样性指数

序列数据质控后，共获得304 277条序列长度大于200 bp的有效序列，其中B组含优质序列153 952条，C组含优质序列150 326条，样品的优质序列长度主要分布在223～230 bp。

从表1样品的多样性分析结果看，不同组别的微生物多样性存在差异。ACE、Chao、Simpson和Shannon指数均用于描述样品的细菌群落多样性，指数越大，表明其群落丰富度越高[16]。细菌的多样性和丰度指数基本与OTU数据变化相一致，C组样品中微生物的Chao 指数、ACE指数和Shannon指数皆高于B组，且OTU数量也更多，表明C组样品中的菌群物种较多，丰富度较高。

2.2 群落结构

表2展示了不同组别丰度占比排列前13位的门水平微生物群落分布情况。将门水平相对丰度小于0.5%的菌门归类为其他。其中变形菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、绿菌门等相对丰度较高，为优势菌群，相对丰度占比分别是37.32%、16.66%、10.95%、8.68%，占总量的73.61%。

表2 B组和C组样品微生物门水平的相对丰度

在门和属水平层次上对B组和C组的同类OTU聚类，进行组间显著性差异分析并绘图，P值小于0.05的认定为存在显著差异，其中前15个优势属及优势门详见图1及图2。由图可知，在门水平上，变形菌门的相对丰度最高，放线菌门和衣原体门具有显著差异性；在属水平上，绿菌属的相对丰度最高，红游动菌属具有显著差异性。

*—差异显著(P<0.05)。图2 同。图1 B组和C组门水平的丰度差异性分析

图2 B组和C组属水平的丰度差异性分析

2.3 聚类

基于OTU数据进行聚类分析后得到图3。树枝的长度以及宽度分别表示不同样品之间的距离和远近，在相似度接近的情况下，距离会越小[17]。通过样品的聚集树可以表明，种植风车草组与未种植风车草组基质菌落都具有明显的聚类特征。B组与C组OTU经相似性分析得出R值为0.458 3，P值为0.033。总体上看，种植风车草组和未种植风车草组存在差异，聚集成了2个互相独立的大组。

图3 B组和C组OTU水平的聚类分析

3 讨论

人工湿地是城市内进行水质净化的新兴力量，人工湿地基质微生物的群落结构与多种因素有关。本实验通过对比有无种植风车草情况下砾石表面基质生物膜的群落构成差异，运用16S rDNA 高通量测序技术对湿地基质微生物多样性进行了探究。研究的结果显示，风车草会对湿地基质微生物群落的组成产生影响。

3.1 风车草对人工湿地微生物多样性的影响

本研究结果表明，种植风车草组微生物丰富度和多样性高于未种植风车草组。这和王芬等[18]关于植物根际与非根际菌群分析的研究结论相似。湿地是碳氮循环的重要发生场所。湿地基质表面微生物的群落结构差异除与基质有关，还会受植物理化性质的影响[19-20]。植物作为影响人工湿地微生物群落结构的因素之一，除根际碳沉积作用外，根系泌氧也会对微生物碳源代谢活性产生影响[21]。植物通过将光合作用产生的氧气输送至根区，可在根际土壤中创造好氧环境，为微生物提供氧气，促进微生物生长繁殖[22]。另外植物根系及其分泌物可以支持微生物的生长。相关资料表明，植物根系能释放多种化合物, 这些物质包含高分子量的多聚糖和低分子量的有机物[23]，而这些有机物正是微生物生长繁殖所需的。因此，人工湿地微生物的多样性与植物存在密切关联，从而形成了不同的微生物群落特性。

3.2 风车草对人工湿地微生物群落结构的影响

2种人工湿地基质优势菌群皆为变形菌门、绿弯菌门、厚壁菌门等，姜磊等[24]在对植被恢复的岩溶湿地沉积物细菌群落的研究中也有相似的结论。本实验中，2个组别的变形菌门相对丰度平均都在35%以上且组间差异不明显，表明变形菌门的菌类在人工湿地生态环境构筑和物质循环里发挥了重要功能，也侧面论证了An等[25]关于不同类型的湿地中菌落结构具有一定相似性的观点。另外在群落结构中进行丰度差异分析时，在门水平上，放线菌门和衣原体门的丰度在2组间具有显著差异性。放线菌属于革兰氏阳性菌且具有分解纤维素的能力[26]，而植物在生长过程中会产生正常的植株枯死叶片凋落现象，为放线菌提供底物条件，这或是使其相对丰度显著高于无植物组的原因。衣原体是一类专性真核细胞内寄生、可以在多种真核生物宿主 (包括人、动物、原虫等) 中繁殖的无运动能力的细菌[27]。而根际内聚集的大量真菌为土壤动物提供了丰富的食物来源[28]，也因此吸引了众多的土壤动物成为衣原体的宿主，使得衣原体门相对丰度得以提高。在属水平上，2组间红游动菌属的丰度具有显著差异。在关于裸土和种植有西洋参的根际土壤菌落研究中也存在类似现象[29]，后续研究中或可以继续进行关注。