老年急性冠脉综合征病人血清α1抗胰糜蛋白酶水平及其临床意义

左广锋 谢浩 任晓敏 郑亚国 金国珍 林松

急性冠脉综合征(ACS)包括急性心肌梗死(AMI)和不稳定型心绞痛(UAP)，为心血管急危重症，死亡率高[1]。高龄是发生心血管事件不可逆的危险因素，老年ACS 病人常具有冠脉病变复杂、 症状不典型、 脏器储备差、病情进展快、合并症多等特点，不良事件发生率也较高，严重影响老年人生命健康和生活质量[2]。炎症反应及冠脉内皮细胞受损被认为是引起ACS发病的两个重要的触发机制[3]。已有研究显示，随着年龄增长，促炎因子如IL-1、IL-6、 TNF-α表达增加，内皮受损，导致心血管疾病发病率及死亡率上升[4-5]。抑制促炎因子表达及改善内皮功能是预防及治疗老年ACS的重要策略。

α1抗胰糜蛋白酶(AACT)又被称为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白A3(serpinA3)，在脑组织、骨骼肌、心肌、血管、肾脏、肺和脾脏等组织中广泛表达，其作为促炎因子与炎症反应及多种疾病如糖尿病、心力衰竭、肿瘤等密切相关，已成为心血管领域的研究热点[6-9]。Zhao等[10]报道了AMI后血浆中serpinA3水平升高，与主要不良心血管事件(MACE)密切相关，其可能作为预测AMI临床预后的潜在血清标志物。但AACT是否可以作为ACS诊断标志物，以及是否促发血管内皮细胞炎症反应，目前未见报道。本研究旨在通过检测ACS病人血清中AACT水平，以及AACT干预人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)后的炎症指标水平，探讨其在ACS诊断中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象及一般资料 从2020年1月1日至2021年6月30日，连续入选178例在我院心脏病中心进行冠脉造影的老年病人。本研究包括4组：52例AMI 病人, 男28例, 女24例，年龄61～88岁，平均 (72.5±10.3)岁；56例 UAP 病人，男30例，女26例，年龄60～85岁，平均 (71.3±10.7 )岁； 40例稳定型心绞痛(SAP)病人，男22例，女18例，年龄61～82岁，平均 (70.5±10.4)岁；对照组(C组)30例, 男16例，女14例，年龄60～80岁，平均 (70.2±9.5) 岁。AMI、UAP诊断标准参照《急性冠脉综合征急诊快速诊治指南 (2019年版)》[11]；SAP诊断标准参照欧洲心脏病学会SAP诊断指南 (2013年版)[12];具有胸闷胸痛或不典型症状，心肌坏死标志物正常，且接受诊断性冠脉造影证实冠状动脉正常或几乎正常的病人，被定义为C组。本研究纳入标准：病人病例资料完整；年龄≥60岁；所有病人均完善冠脉造影检查；病人自愿参与研究并签署知情同意书。排除标准：恶性肿瘤；全身炎症性疾病；严重肝、肾功能不全；严重室性心律失常；需要心脏手术的严重瓣膜性心脏病。4组年龄、性别构成比差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经南京医科大学附属南京医院伦理委员会审批通过。

1.2 研究方法

1.2.1 一般临床资料收集：收集年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病、血脂异常、肝肾功能是否异常等资料。

1.2.2 病例诊断：所有入选者均行冠脉造影检查，结果由2位心脏介入专科医师阅读分析，冠状动脉中至少有1支血管狭窄≥50%，并结合临床症状、心电图表现及心肌坏死标志物判定病人属于AMI、UAP还是SAP。

1.2.3 标本采集：入选者入院后首次化验检查时一并采集外周静脉血5 mL，肝素钠抗凝，室温静置2 h，3000 r/min，离心15 min，小心吸取上清，将上清置于-80 ℃超低温冰箱中保存待用。

1.2.4 ELISA检测：应用武汉华美生物工程有限公司人种属AACT试剂盒(货号：CSB-E08957h)以及人种属IL-6试剂盒(货号：CSB-E04638h)分别检测血清中AACT、IL-6的水平。酶标仪型号为DENIEY DRAGON Wellscan MK 3 (芬兰Thermo)，分析软件为Ascent Software for Multiskan。

1.2.5 HCAEC培养及处理：购买武汉普诺赛生命科技有限公司HCAEC(货号：CP-H087)及HCAEC完全培养基(货号：CM-H087)。人重组AACT蛋白(武汉华美，货号：CSB-YP021059HU)用PBS溶解配置成100μg/mL母液，然后分别应用10 ng/mL、100 ng/mL处理HCAEC。选择最佳处理浓度的AACT预处理1 h，然后再分别处理12 h、24 h及48 h，PBS处理用作对照组。

1.2.6 Western Blot检测：提取AACT处理及未处理后的HCAEC蛋白，进行电泳及转膜，然后分别应用AACT抗体(1∶1000稀释，美国Proteintech，66078-1-Ig)、IL-6抗体(1∶1000稀释，美国Proteintech，66146-1-Ig)进行孵育，再孵育二抗(1∶1000稀释，美国Cell Signaling Technology，7074S，7076S)。成像设备型号为GeneGnome XRQ(英国Syngene)，分析软件为Image J。

2 结果

2.1 一般资料比较 AMI组、UAP组及SAP组病人吸烟、血脂异常及合并糖尿病的比例均显著高于C组(P<0.01)，AMI组、UAP组血脂异常及合并糖尿病的比例高于SAP组(P<0.05)。见表1。

表1 4组一般资料比较(n，%)

2.2 血清中AACT及IL-6水平比较 AMI组、UAP组血清中AACT及IL-6的水平均显著高于SAP组及C组(P<0.01)，且AMI组血清中AACT及IL-6的水平高于UAP组(P<0.05)，而SAP组与C组之间两指标差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表2。

表2 4组血清AACT及IL-6水平比较

2.3 AACT对ACS的诊断价值 ROC曲线下面积为0.951(95%CI：0.909～0.978，P<0.01)，血清AACT诊断ACS的最佳界值为12.40 ng/mL，灵敏度为84.26%，特异度为84.29%。见图1。

图1 ROC曲线评价AACT对ACS的诊断价值

2.4 AACT促进HCAEC中IL-6表达上调 Western Blot显示人AACT 重组蛋白处理HCAEC后，AACT蛋白表达明显高于对照组及PBS处理组(图2a)。且AACT(100 ng/mL)促进HCAEC IL-6蛋白表达上调(图2b)。

注：a：Western Blot检测AACT 或PBS处理HEAEC后AACT的蛋白表达(n=5)；b： Western Blot检测AACT处理HEAEC不同时间后IL-6的蛋白表达(n=5)。与对照组(Control)或PBS组比较，*P<0.05, ** P <0.01; 与0 h组比较，#P<0.05, ## P <0.01图2 人AACT 重组蛋白促进HCAEC中IL-6 蛋白表达上调

3 讨论

ACS是冠心病最严重的一种类型，其特征是冠状动脉血流量显著减少[3]。炎症反应和因其引起的内皮受损，被认为是触发ACS的重要机制[13-14]。高龄是发生心血管事件不可逆的独立危险因素。老年人会出现炎性衰老，即血液中有较高的炎性标志物，其与心血管疾病、慢性肾病、糖尿病等多种疾病及衰弱、死亡密切相关[15]。因此，检测血清中炎症因子水平有助于诊断和预测老年ACS的发生、发展和预后。

AACT是serpin家族成员，该家族一共包括36个亚型，起着抑制丝氨酸蛋白酶的作用[10]。AACT是一种急性相反应蛋白，参与炎症反应及多种疾病，如心血管疾病、糖尿病、肿瘤等[6-9，16]。Wågsäter等[17]发现，在人动脉粥样硬化斑块的内皮细胞及中层平滑肌细胞中，AACT表达明显上调；在ApoE敲除小鼠的动脉粥样斑块中也发现类似结果。Cheow等[18]报道了AACT参与不稳定斑块破裂诱导的心肌损伤。炎症反应与内皮受损参与动脉粥样硬化形成及破裂，共同构成了ACS发生的病理生理学基础[19-20]。因此推测循环血中AACT水平增加可能与老年ACS发生密切相关。本文结果显示，老年ACS病人血清中AACT水平显著高于SAP组及对照组，且AMI病人高于UAP病人；ROC曲线分析显示血清AACT水平对ACS有良好的诊断价值。这些结果表明，检测血清中AACT的水平有助于老年ACS的临床诊断。

ACS是一种复杂的炎症综合征，其特征是血液中炎性因子明显增加，这些炎性因子可能与AACT协同作用并受其调控[10]。IL-6在ACS发生、发展过程中起着非常重要的作用，其介导白细胞黏附，削弱斑块处纤维帽，增加并促进斑块的不稳定性，加速斑块裂隙发生，最终导致斑块破裂、血栓形成[21-22]。本研究结果显示，老年ACS病人血清中IL-6水平较SAP组及对照组明显升高；在体外，AACT处理HCAEC后，IL-6 蛋白水平以时间依赖性方式上调。据此，推测AACT诱导IL-6致炎，引起内皮受损，触发ACS。因此，检测老年ACS病人血清中AACT水平，对老年ACS病人的诊断及预后评估具有重要的临床意义。但本研究样本量较少，仍需要进一步的随机对照研究去验证。