miR-193a-5p/HOXA7轴对急性髓细胞白血病细胞增殖与凋亡的影响

何 迪，李 斌，喻镁佳，陈 琪

急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种常见的血液系统恶性肿瘤，病情凶险，易复发，具有严重致死性，其发病率逐年上升[1]。目前AML治疗进展缓慢，常用治疗方法有联合化疗、诱导分化和造血干细胞移植等，尽管对AML的生物学特征的理解日渐深入，新的靶向治疗药物被研发使用，但总体生存率仍低、治疗效果仍然不够理想[2]。研究[3]表明白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs)是白血病细胞恶性增殖的罪魁祸首，而这些细胞具有高增殖、低凋亡、分化阻滞、耐药等特性，导致白血病患者在放化疗得到完全缓解后复发率仍非常高。因此，阐明调控LSCs增殖凋亡分子机制，对AML的治疗具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNAs)调控多种生物学行为，如发育的进程、干细胞分化、细胞凋亡、疾病以及肿瘤发生等，近些年受到广泛关注。miR-193a-5p作为miRNAs的一员，以同源盒基因A7(homeobox protein hox-A7,HOXA7)作为靶基因对卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等癌细胞的增殖凋亡进行调控[4-7]，但是其在AML中的作用以及对LSCs增殖凋亡的影响尚不得知。该研究在AML细胞系THP-1上探究miR-193a-5p对LSCs增殖凋亡的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1病例资料 白血病骨髓样本来自2019年1月—2021月7月云南大学附属医院血液内科行骨髓穿刺的52例初治AML受检者，其中男28例，女24例；年龄34～58(41.32±4.97)岁；正常骨髓样本来自同期血液内科行骨髓穿刺的50名健康志愿者，其中男29例，女21例；年龄31～56(43.01±5.28)岁。上述骨髓样本的取材均获得受检者知情同意并签署知情同意书。

1.1.2实验材料与主要试剂 HEK293T细胞与THP-1细胞购自上海研生实业有限公司；慢病毒载体由北京博恒科创生物科技有限公司制备；质粒由北京博恒科创生物科技有限公司制备。GAPDH、Caspase-3和PARP-1抗体购自北京沃卡威生物技术有限公司；Annexin Ⅴ-PI凋亡染色试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购自上海圣尔生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自上海弗元生物科技有限公司。

1.1.3实验仪器 组织匀浆机购自北京中科科尔仪器有限公司；酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司；流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特有限公司；光学显微镜购自上海光学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1荧光素酶活性检测 HEK293T细胞用含100 g/L胎牛血清的DMEM高糖培养液，于37 ℃、50 g/L的饱和湿度条件下培养、传代，实验用对数生长期细胞。查找HOXA7基因序列并通过聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)进行扩增，将扩增产物插入荧光素酶报告载体pGL3，构建野生型HOXA7载体，同时对HOXA7序列中与miR-193a-5p结合的位点进行TCACG到ATGGC的点突变，构建突变载体，按照操作说明使用转染试剂lipofectamineTM3000将质粒与miR-193a-5p mimic或mimic-NC共转染HEK293T细胞48 h，利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组细胞荧光素酶活性，实验重复3次。

1.2.2THP-1细胞培养与转染处理 THP-1细胞在37 ℃、5% CO2、含10% FBS的DMEM培养液中培养，取对数生长期的THP-1细胞株，将细胞分为空白对照组、miR-193a-5p过表达组、HOXA7 shRNA组、联合过表达组。空白对照组细胞转染慢病毒空载体；miR-193a-5p过表达组细胞转染miR-193a-5p过表达慢病毒载体；HOXA7 shRNA组细胞转染HOXA7 shRNA慢病毒载体；联合过表达组细胞转染miR-193a-5p过表达慢病毒载体和HOXA7过表达慢病毒载体。待细胞生长稳定后，采用实时荧光定量PCR技术和Western blot法检测细胞内miR-193a-5p和HOXA7的表达水平，确定转染是否成功。

1.2.3实时荧光定量PCR 骨髓样本采用磁珠法分离骨髓细胞中的CD34+CD38-细胞。分别取分离的CD34+CD38-细胞和THP-1细胞，采用Trizol法提取心脏组织或者细胞中RNA，然后反转录获得cDNA，采用实时荧光定量PCR检测细胞中miR-193a-5p和HOXA7表达水平，以GAPDH和U6作为内参。miR-193a-5p引物：上游5′-CGGAGCCAAGATTTGATCGA-3′，下游5′-GTGCGCCTGATAAGTAGCAA-3′；HOXA7引物：上游5′-ATGCACCTGCAGAGGTATAG-3′，下游5′-AGAGGAGGTTCGCAACTCTA-3′；GAPDH引物：上游5′-CGCCGTATCTGATGGCGT-3′，下游5′-CGGGAGTCTAGCAGAGTTGACTA-3′；U6引物：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3′。

1.2.4Western blot检测 分别取分离的CD34+CD38-细胞和THP-1细胞，然后加入1 ml RIPA裂解液，使用组织匀浆机对细胞进行匀浆，匀浆后的细胞放于冰上裂解5 min，之后4 ℃，在10 000 r/min速度下离心5 min，取上清液；然后往上清液中加入loading buffer(上清液体积 ∶loading buffer体积=4 ∶1)；SDS-PAGE跑胶、转膜，转印蛋白的膜用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，之后依次加入抗人Caspase-3抗体(1 ∶1 000)、PARP-1抗体(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)抗体4 ℃孵育12 h，然后使用HRP标记的二抗37 ℃孵育1 h，最后加入ECL发光液曝光检测。

1.2.5CCK-8检测 收集稳定转染的THP-1细胞，使用CCK-8试剂盒检测各组的THP-1细胞增殖情况，具体步骤如下：将稳定转染的细胞接种到96孔板中，待细胞生长80%时，向每孔加入10 μl的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.6细胞计数 取培养板中培养细胞，在显微镜下对各组培养孔中细胞进行拍照，然后收集细胞，离心，弃培养基，用PBS重悬细胞，然后使用细胞计数仪对各组细胞数量进行计数。

1.2.7THP-1细胞凋亡检测 将稳定转染的细胞接种到96孔板中，待细胞生长至实验截止时，收集细胞，然后立即使用Annexin Ⅴ-PI凋亡染色试剂盒和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒并采用绿色FITC标记荧光检测法对分离的细胞进行染色。流式细胞术分析：使用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行分析，采用固定流速(6 ml/min)，收集1 min，Q1+Q2+Q3细胞即为发生凋亡的细胞。TUNEL染色分析：具体方法参照试剂盒说明书，通过光学显微镜观察细胞凋亡状况。

2 结果

2.1 各组荧光素酶活性比较荧光素酶检测显示，miR-193a-5p mimic能够降低HOXA7野生型荧光素酶活性(P<0.01)，而对HOXA7突变型荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)，见表1。

表1 各组荧光素酶活性比较

2.2 AML患者骨髓细胞中miR-193a-5p及HOXA7表达水平变化AML骨髓CD34+CD38-细胞中miR-193a-5p表达水平低于健康志愿者骨髓CD34+CD38-细胞中水平，而AML骨髓CD34+CD38-细胞中HOXA7 mRNA和蛋白表达水平高于健康志愿者骨髓CD34+CD38-细胞中水平(P<0.01)，见图1。

图1 AML患者骨髓细胞中miR-193a-5p及HOXA7表达水平变化

2.3 各组THP-1细胞中miR-193a-5p及HOXA7表达水平变化miR-193a-5p过表达组和联合过表达组THP-1细胞中miR-193a-5p表达水平高于空白对照组(P<0.01)；联合过表达组THP-1细胞中HOXA7 mRNA和蛋白表达水平高于空白对照组，而miR-193a-5p过表达组及HOX7A shRNA组HOXA7 mRNA和蛋白表达水平低于空白对照组(P<0.01)。见图2。

图2 各组THP-1细胞中miR-193a-5p及HOXA7表达水平变化

2.4 各组THP-1细胞增殖情况比较与空白对照组比较，miR-193a-5p过表达组及HOXA7 shRNA组THP-1细胞增殖受到抑制且细胞数量减少(P<0.05)；联合过表达组THP-1细胞增殖以及细胞数量优于空白对照组(P<0.05)，见图3。

图3 各组THP-1细胞增殖情况比较

2.5 各组THP-1细胞凋亡情况比较miR-193a-5p过表达组及HOXA7 shRNA组THP-1细胞凋亡比例高于空白对照组，且HOXA7 shRNA组THP-1细胞凋亡比例高于miR-193a-5p过表达组(P<0.01)；联合过表达组THP-1细胞凋亡百分比分别低于空白对照组、miR-193a-5p过表达组及HOXA7 shRNA组(P<0.01)，见图4。

图4 各组THP-1细胞凋亡情况比较

2.6 各组THP-1细胞凋亡蛋白表达情况比较miR-193a-5p过表达组及HOXA7 shRNA组THP-1细胞活化的Caspase-3和PARP1量高于空白对照组，且HOXA7 shRNA组THP-1细胞活化的Caspase-3和PARP1量高于miR-193a-5p过表达组(P<0.01)；联合过表达组THP-1细胞活化的Caspase-3和PARP1量分别低于空白对照组、miR-193a-5p过表达组及HOXA7 shRNA组(P<0.01)，见图5。

图5 各组THP-1细胞凋亡蛋白表达情况比较

3 讨论

近年来，miRNAs在AML发生与发展过程中的作用受到了广泛关注。作为miRNA的一员，miR-193a-5p在肿瘤细胞增殖、生长过程中展现出较为重要作用。研究[8-10]表明，miR-193a-5p在卵巢癌、肝癌、胃癌等肿瘤细胞中表达水平降低，且上调肿瘤细胞中miR-193a-5p水平后可有效抑制肿瘤细胞增殖，表明miR-193a-5p具有调控肿瘤细胞增殖的能力。研究[11]表明，AML初发和复发患者血浆miR-193a-5p表达水平低于缓解AML患者或健康受试者血浆水平，但miR-193a-5p在LSCs增殖生长过程中的作用尚不得知。

HOXA7作为HOX基因家族的一员，是造血细胞增殖分化的主控基因。研究[12]表明，HOXA7在白血病中的表达及功能受多种上游因子的调控，可在各种协同作用分子或HOX基因的影响下作用于下游靶基因，参与白血病的发生发展。HOXA7可影响白血病的临床表现，且其表达水平与白血病的治疗与预后有较大关联[13]。此外，HOXA7在肿瘤细胞增殖过程中扮演重要角色[14]。生物信息学分析发现，HOXA7是miR-193a-5p直接作用的靶分子。miR-193a-5p通过结合HOXA7基因的TCACG位点，调节HOXA7的mRNA及蛋白表达水平。本研究的荧光素酶活性检测发现，miR-193a-5p不影响结合位点突变的HOXA7荧光素酶活性，却能降低野生型HOXA7荧光素酶活性，实验证明miR-193a-5p具有调控HOXA7的功能。AML患者和健康受试者骨髓中LSCs(CD34+CD38-细胞)miR-193a-5p表达水平的比较结果显示，AML患者骨髓CD34+CD38-细胞内miR-193a-5p表达水平降低，而HOXA7表达水平升高。

进一步THP-1细胞培养结果显示，过表达miR-193a-5p或抑制HOXA7表达能够抑制THP-1细胞增殖、促进THP-1细胞凋亡蛋白Caspase-3和PARP1活化及细胞凋亡，这与之前研究人员[15]关于HOXA7的功能相一致。但是同时过表达miR-193a-5p和HOXA7时，miR-193a-5p对THP-1细胞增殖及凋亡的影响作用则消失，甚至同时过表达miR-193a-5p和HOXA7时反而进一步促进了THP-1细胞增殖，THP-1细胞凋亡则被抑制。考虑到HOXA7具有促进肿瘤细胞增殖的功能，发生这种现象的解释是miR-193a-5p可通过抑制HOXA7的表达继而抑制THP-1细胞增殖及促进细胞凋亡，同时过表达HOXA7时抵消了miR-193a-5p的生物学作用，而过表达的HOXA7进一步促进了THP-1细胞的增殖生长。

综上所述，miR-193a-5p在AML患者骨髓细胞中表达量降低，其可通过抑制HOXA7表达抑制THP-1细胞增殖、促进THP-1细胞凋亡。本研究为临床治疗AML提供了新的思路。