抗虫玉米CM8101定性检测方法的建立

温洪涛，杨洋，丁一佳，苑冉，张瑞英，徐志远，梁晋刚

1.黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所，哈尔滨 150086；2.东北农业大学农学院，哈尔滨 150038；3.农业农村部科技发展中心，北京100176

近年来，转基因技术在农作物生产领域发展十分迅猛，根据国际农业生物技术应用服务组织（International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications，ISAAA）统计，2019年全球转基因作物种植面积达到了1.904 亿hm2，转基因玉米约占6 090万hm2，其中绝大多数为抗虫/耐除草剂叠加性状的玉米［1］。随着转基因植物不断地商业化种植与加工，转基因作物的安全监管和标识管理工作也逐渐被政府和社会重视，工作内容因此日益复杂繁重［2-4］。这就对服务于监管的转基因作物检测方法相关研究工作提出了更高的要求——亟需建立起更多有效、灵敏、特异的检测方法，使之能充分满足安全监管工作的需要［5］。

转基因抗虫玉米CM8101 是中国农业科学院作物科学研究所研发的新型抗虫玉米，研发团队将经过密码子优化后的Cry1Ab-Ma基因表达载体，采用农杆菌法导入受体玉米材料HiⅡ中，从而获得抗虫性状优良的玉米转化材料。进一步通过将抗性优良的转化体与郑58 进行多代回交及自交，获得玉米CM8101［6-9］。目前该转基因玉米已经进入生产性试验阶段。龙丽坤等［10］建立了转基因玉米CM8101 实时荧光定量PCR 检测方法，但当前尚未见有针对抗虫玉米CM8101 及其衍生品种特异性定性检测方法的相关报道。

普通PCR 和实时荧光PCR 方法是目前应用最为广泛的转基因产品检测方法［11］，我国现有的转化体特异性检测标准方法中以普通PCR 方法应用最多，其次是实时荧光PCR 法，两种方法都有其不可替代的优点，普通PCR 方法成本更低且普适性高，实时荧光PCR 方法对实验室产生的污染少且具有更高的灵敏度［12-14］。本研究以转基因玉米CM8101 的5′端转化体特异性序列为靶标，设计特异性引物，利用普通PCR 和实时荧光PCR技术，建立了转基因抗虫玉米CM8101 特异性定性检测方法，以期为国家对转基因玉米CM8101的知识产权保护和安全评价监管提供更有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

转基因抗虫玉米CM8101 及其受体材料由农业农村部科技发展中心提供，5 种作物转基因混合样品为本实验室保存样品。

植物DNA 提取试剂盒购自杭州新景生物试剂开发有限公司；GoTaq®Green Master Mix 普通PCR试剂盒购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；iTaqUniversal Probes Supermix 实时荧光PCR试剂盒购自美国Bio-Rad公司。

1.2 仪器与设备

Nanodrop ND-2000 核酸定量仪、MiniAmp 普通PCR 仪、ABI 7500 实时荧光PCR 仪均为美国Thermo Fisher Scientific 公司生产；VX-200 旋涡混匀仪为美国Labnet 公司生产；5424R 台式离心机为德国Eppendorf 公司生产；H2O3-PRO 金属浴购自北京卡尤迪公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA 提取 所有材料的基因组DNA 提取方法参照新景生物试剂开发公司的植物DNA 提取试剂盒说明书。

1.3.2 引物、探针设计及最佳引物组合筛选 根据中国农业科学院作物科学研究所提供的CM8101 玉米外源载体插入片段的5'端侧翼序列信息，采用引物设计软件Oligo 7，设计6 条上游引物、5 条下游引物和1 条探针，引物探针序列见表1，共得到16 个普通PCR 引物组合和13 个实时荧光PCR 引物组合，以CM8101 基因组DNA 为模板对所有引物组合进行筛选，并设置阴性对照和空白对照。

表1 引物和探针信息Table 1 Primers and probes

1.3.3 反应体系和条件的优化 普通PCR检测方法：设置5个引物终浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1）和3个退火温度（56、58、60 ℃）对最佳引物组合进行优化。反应体系：Go Taq®Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物据上述终浓度确定，DNA 模板50 ng，用双蒸水将总体积补足至25 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min ；94 ℃变性30 s，梯度退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35 次循环；72 ℃终延伸7 min，16 ℃保存。PCR 扩增反应结束后，取6 μL PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并比较结果。

实时荧光PCR 检测方法：设置4 个引物和探针终浓度（0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1）对最佳引物组合进行优化，引物和探针共16 个浓度组合（表2）。反应体系：iTaqUniversal Probes Supermix 12.5 μL，引物、探针按上述终浓度确定，DNA模板50 ng，用双蒸水将总体积补足至25 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸60 s，共40 个循环；在第二阶段的退火延伸（60 ℃）时段收集荧光信号，反应结束后分析并比较实时荧光PCR扩增效果。

表2 引物和探针浓度组合Table 2 Combinations of different concentrations of primer and probe

1.3.4 特异性验证 依照优化好的普通PCR 和实时荧光PCR 方法对选取的7种样品进行特异性验证，并设置空白对照。特异性验证样品包括：阴性对照；1%的转基因抗虫玉米CM8101；其他转基因玉米混合样品（3272、59122、Bt11、Bt176、GA21、NK603、T25、TC1507、MIR604、MON810、MON863、MON87460、MON88017、MON89034）；转基因水稻混合样品（M12、TT51、克螟稻、科丰6 号、科丰8号）；转基因大豆混合样品（305423、356043、A2704-12、A5547-127、CV127、GTS40-3-2、MON89788）；转基因棉花混合样品（LLCOTTON25、MON1445、MON15985、MON531、MON88913）；转基因油菜混合样品（RF1、RF2、RF3、MS1、MS8、Oxy235、T45、Topas19/2）。转基因混合样品中的每种转化体含量均为1%。

1.3.5 灵敏度测试 将优化好的普通PCR 和实时荧光PCR 方法对选取的不同质量分数的CM8101样品进行灵敏度测试，普通PCR 设置5个不同质量分数的CM8101 样品：1.00%、0.50%、0.10%、0.05%和0.01%，实时荧光PCR 设置7 个不同质量分数的样品：50.00%、10.00%、1.00%、0.50%、0.10%、0.05%和0.01%，设置空白对照，每个样品重复3次，反应结束后分析灵敏度测试结果。

1.3.6 检出限测试 依据1.3.5 中灵敏度测试结果，对可检出最低质量分数的样品分别随机取样60份，提取DNA后分别进行普通PCR和实时荧光PCR 方法的检出限测试，若60 份测试样品中≥59份样品的测结果为阳性，则将该样品的质量分数确定为方法的检出限。

2 结果与分析

2.1 最佳引物组合筛选分析

为得到最佳引物组合，对所设计的组合分别进行普通PCR 筛选和实时荧光PCR 筛选。普通PCR 扩增结果（图1）显示，16 个引物组合均能扩增出目的条带，其中组合9和组合14特异性良好，其他组合均有不同程度的非特异扩增，结合引物扩增效率，最终选定组合9（LB-F5/R2）为普通PCR 检测方法的最佳引物组合。实时荧光PCR扩增结果（图2）显示，13 个引物探针组合均能获得扩增曲线，且特异性良好，结合扩增效率，最终选定组合1（LB-F1/R1/P）为实时荧光PCR 检测方法的最佳引物探针组合。

图1 转基因玉米CM8101普通PCR方法的引物组合筛选测试Fig.1 Primer combination screening test of general PCR method for transgenic maize CM8101

图2 转基因玉米CM8101实时荧光PCR方法的引物组合筛选测试Fig.2 Primer combination screening test of real-time PCR method for transgenic maize CM8101

2.2 反应体系和反应条件的优化

普通PCR 检测方法中，通过退火温度（56、58、60 ℃）和引物浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1）的正交测试，确定引物终浓度为0.4 μmol·L-1、退火温度为58 ℃，此条件下引物扩增效率最高，特异性最高（图3）。

图3 普通PCR方法反应体系和反应条件的优化Fig.3 Optimization for reaction system and conditions of general PCR

实时荧光PCR 检测方法中，不同引物浓度和探针浓度正交组合测试结果表明，引物浓度和探针浓度在0.4 μmol·L-1以上时Ct值差异并不明显（图4），综合体系配置和平台期信号强度等因素，确定引物浓度为0.4 μmol·L-1，探针浓度为0.4 μmol·L-1。

图4 实时荧光PCR反应引物浓度优化Fig.4 Optimization for primer concentration of real-time PCR

2.3 特异性分析

为测试抗虫玉米CM8101 两种定性PCR 检测方法的特异性，对质量分数为1%的CM8101 和5种转基因作物混合样进行测试，检测结果（图5和图6）表明，仅有CM8101 转基因玉米样品可获得预期目的片段（173 bp）和扩增曲线，表明建立的抗虫玉米CM8101 定性PCR 检测方法具有高度特异性。

图5 转基因玉米CM8101普通PCR方法的特异性测试Fig.5 Specificity test for general PCR of GM maize CM8101

图6 转基因玉米CM8101实时荧光PCR方法的特异性测试Fig.6 Specificity test for real-time PCR of GM maize CM8101

2.4 灵敏度测试

普通PCR 灵敏度测试结果（图7）显示，在质量分数为≥0.1%的样品中均能扩增到预期DNA片段，重复性良好，即普通PCR 检测方法的灵敏度可稳定达到0.1%。

图7 转基因玉米CM8101普通PCR方法的灵敏度测试Fig.7 Sensitivity test for general PCR of GM maize CM8101

实时荧光PCR 灵敏度测试结果（图8）显示，质量分数为≥0.05%的样品中均能获得预期扩增曲线，重复性良好，即实时荧光PCR 检测方法的灵敏度可稳定达到0.05%。

图8 转基因玉米CM8101实时荧光PCR方法的灵敏度测试Fig.8 Sensitivity test for real-time PCR of GM maize CM8101

2.5 检出限测试

依据灵敏度测试结果（图9），普通PCR 方法中，随机抽取60 份CM8101 转化体质量分数为0.1%的样品进行检出限测试，结果显示，60 次反应全部扩增出目的条带，可以确定普通PCR 方法的检出限为0.1%。

图9 转基因玉米CM8101普通PCR方法的检出限测试Fig.9 Detection limit test for general PCR of GM maize CM8101

依据灵敏度测试结果（图10），实时荧光PCR方法中，随机抽取60 份CM8101 转化体质量分数为0.05%的样品进行检出限测试，结果显示，60次反应全部出现典型扩增曲线，平均Ct值为36.19，可以确定实时荧光PCR方法的检出限为0.05%。

图10 转基因抗虫玉米CM8101实时荧光PCR方法的检出限测试Fig.10 Detection limit test for real-time PCR of GM maize CM8101

3 讨论

目前商业化转基因玉米中以抗虫耐除草剂叠加性状的品系种植最为广泛，由于技术相对成熟且认可度较高，国内外对这两种性状的研发力度均在持续加强，是不同研发公司间竞争最为激烈的性状。CM8101 作为我国具有自主知识产权的抗虫玉米，由于性状表现优良，其研发目前已经进入生产性试验阶段，具有很高的应用价值和推广价值，因此，未来该转化事件有望获得转基因生物安全证书，从而最终进入市场，因此本方法的成功研发对未来针对该转化事件的监管工作提供了有力的技术支撑。

当前针对转基因作物主流的检测技术仍以针对核酸为靶标的PCR 方法为主，相较于其他方法，PCR 方法的特点是更加准确、稳定，因此监管部门在针对转基因材料进行定性时对PCR 方法也最为认可［15］。特别是近年来针对转化体特异性的PCR 定性检测方法已成为国内外转基因产品检测方法标准的首选［16-20］，本文研究了普通PCR和实时荧光PCR 这两种技术在CM8101 定性检测中的应用，并分别建立了针对CM8101 事件特异性的定性检测方法，这两种方法具有着各自的优缺点：普通PCR 检测成本低，仪器普及程度更高，但由于其必须通过凝胶电泳进行检测，因此通量较低且极易产生污染；实时荧光PCR 成本稍高，检测仪器较昂贵，但其可通过扫描反应体系中的荧光直接获得结果，无需开盖检测，因此避开了最容易污染的环节，并且由于该方法还可选用384通道等高通量的适配器进行试验，使其效率远高于普通PCR，从而节省了大量时间。两种方法的建立能够给使用者更多的选择空间，同时也能为监管工作提供更好的服务。