基于质谱技术的蛋白质互作研究进展

2022-03-30孙瑞雪米薇叶子弘

生物技术进展 2022年2期

孙瑞雪，米薇，叶子弘

1.中国计量大学生命科学学院，杭州 310018；2.中国计量科学研究院，北京100029

蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）和蛋白-配体相互作用，涉及多种药物作用机制［1］。蛋白-蛋白结合的调节也代表了一种新兴的治疗模式，蛋白质界面为药物开发提供了一类新的靶点。在PPI 中寻找关键的蛋白、发现新的药物靶标、诊断标记物以及治疗靶点，可为相关疾病的治疗和靶向药物的开发提供参考，并可协助探寻疾病成因。单克隆抗体（mAbs）具有作用机制明确、高结合亲和力和对选定靶点有特异性等优势，已成为蛋白质治疗的主要类别［2-3］。蛋白质的功能主要通过与其他蛋白质相互作用来实现，因此PPI 网络是识别遗传变异功能后果的重要工具。与疾病有关的基因突变被定位到细胞过程的重要PPIs，通过引入携带突变的蛋白或病原体蛋白的外源性表达，将疾病状态与野生型参考图进行对比，有望揭示疾病发病过程中网络的变化。

基于质谱技术（mass spectrometry，MS）的蛋白互作方法正蓬勃发展，并越来越广泛地应用于科学研究中。基于质谱的蛋白质组学方法的发展使得通过测定动态蛋白质复合物的组成、翻译后修饰、组装、结构和PPI来全面表征蛋白质复合物成为可能［4］。尽管目前的质谱分析方法在灵敏度和细胞通量方面尚存在缺陷，但使用液滴微流体，可以将样品的检测限从μL 精确到nL，这大大提高了分析性能。到目前为止，基于质谱的蛋白质组学和结构生物学已经越来越广泛地与基于质谱的方法相融合，逐渐被用于补充结构生物学工具［5］。

1 经典的蛋白互作研究方法

研究蛋白质间相互作用的经典方法较多，主要包括生物物理学、生物化学、遗传学等方法。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）可直接作用于活细胞，能够监测实时或者瞬时的PPI，检测相互作用位点，监测复杂的相互作用动力学［6］。表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）具有实时分析、样品用量少、样品无需标记、自动化和中到高通量筛选能力等优势，这广泛地促进了治疗性单克隆抗体的发现和发展［7］。此外，SPR 和MS 的结合为蛋白质间相互作用的鉴定和表征提供了一个非常灵敏的工具［8］，该技术可使用相对少量的材料测量膜蛋白与配体分子互作的实时定量结合亲和力和动力学参数［9］。经典的蛋白互作方法优缺点见表1。

表1 经典的蛋白质互作方法优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of classical protein interaction methods

双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complimentary，BiFC）技术可直接显示活细胞中的PPIs，提供关于PPIs 发生的亚细胞位置的空间信息，该技术灵敏度高，可用于检测内源性或近内源性表达蛋白互作，以及微弱和短暂互作。但它测量PPI 的动态或实时变化并不理想，在某些情况下，它可能检测到假阳性的荧光信号，这与重组片段的荧光强度有关，而与正在研究的两个蛋白质之间（或非特异性）的相互作用无关［10］。

酵母双杂交技术（yeast two-hybrid technique，Y2H）可用于全基因组范围内蛋白质间相互作用的高通量研究，能够在真正的细胞环境中检测体内的相互作用［11］，有助于避免一些与细胞裂解相关的并发症和人为因素［12］。它可以筛选目标基因的互作蛋白，检测瞬时或弱相互作用，绘制蛋白质相互作用图谱，筛选药物靶标，定量检测互作强度。但Y2H 需要两个互作的蛋白进入细胞核以驱动报告基因的转录，所以不适合用于某些细胞膜受体蛋白和细胞外蛋白［13］。在某些情况下使用酵母宿主可能无法检测到来自其他生物体的PPIs，原因是表达不良、缺乏必要的翻译后修饰、辅助因子或其他结合因子［14］。

2 亲和纯化-质谱

亲和纯化-质谱（affinity purification-mass spectrometry，AP-MS）的原理是将目的蛋白固定在固体载体上（最常见的是琼脂糖或磁珠），利用目的蛋白与互作蛋白的相互作用将互作蛋白固定在载体上，从而实现从复杂混合物中的分离，随后将分离得到的混合物用质谱鉴定［15］。

亲和纯化与定量质谱联用已成为研究蛋白质复合物以及整个生物体蛋白质组在体内相互作用的主要方法，这种组合产生高度可靠的蛋白互作数据，通过使用定量蛋白质互作信息，可以将特定蛋白质相互作用物与非特定背景蛋白质区分开［16-18］。但分析AP-MS 实验数据较困难，需要MS专业知识和特定的生物信息学工具。串联亲和纯化（tandem affinity purification，TAP）结合质谱技术可以识别互作蛋白并对蛋白复合物进行纯化，TAP-MS 已被用于分析许多不同生物体中的蛋白互作和蛋白质复合物。同时，TAP 还可以分析突变体对蛋白质相互作用和关联的影响，还可能发现结合位点［19］。

3 生物素鉴定-质谱

生物素鉴定-质谱（biotin identification-mass spectrometry，BioID-MS）的原理是原核生物素连接酶分子（BirA）连接目的蛋白，当细胞中融合蛋白表达后，接近目的蛋白的互作蛋白被生物素化而带上生物素标签，随后用带亲和素的固相载体进行捕获，可分离得到生物素化的蛋白，最后使用MS 鉴定可得到目的蛋白的互作蛋白［20］。BioIDMS 的核心优势是它在天然细胞环境中检测PPIs时，细胞的正常生命活动基本不会受到干扰，通过改变融合蛋白之间连接部分的长度，可以调控检测范围，该技术在蛋白质组学研究领域意义重大。

BioID-MS 还适合识别微弱或瞬时互作、难溶性蛋白互作、翻译后修饰介导的蛋白互作等。它在检测低丰度蛋白方面可能比AP-MS 更有效［21］。该技术被用于鉴定冠状病毒复制、HIV 病毒蛋白互作网、细菌宿主识别、有丝分裂相关蛋白互作等［22］。但低表达水平的PPI 伴侣也可能导致假阴性，在某些情况下，生物素化过程本身可能会对蛋白质的行为/相互作用造成影响。

4 氢氘交换质谱法

4.1 氢氘交换质谱法的原理

氢氘交换质谱法（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX-MS）的原理是蛋白质样品在不同的时间点用氘进行标记，通过降低pH 至2.5 来淬灭交换，氘化的样品保持在0 ℃以避免回交，样品酶解后，用HPLC 及UPLC 分离多肽，最后用MS 检测。因为氘比氢重，质谱信号将逐渐向高质荷比（m/z）方向移动。通过对反应前后HDX-MS 数据的比较，不同HDX-MS 谱的肽段可以突出蛋白与小分子/其他蛋白互作中潜在的相互作用界面［23］。

4.2 氢氘交换质谱法的应用

20 世纪90 年代以来，HDX-MS 在学术界被广泛应用，其中包括对蛋白质复合物、蛋白质结构和功能、配体结合、构象变化和折叠/展开/再折叠的动态特性、由变构效应引起的构象变化等的研究。Puchades 等［24］基于HDX-MS 揭示了溶液中血凝素（hemagglutinin，HA）三聚体的构象动力学。该技术在修饰的氨基酸水平相对较低或在多个位点有修饰时也可用来评估蛋白质翻译后修饰（PTMs）在单个位点的影响。它可以识别抗体-抗原互作表位，了解抗原-抗体的相互作用和识别表位对于设计有效的蛋白治疗药物尤为重要。此外，该技术可进一步辅助药物研发与表征蛋白质治疗的高阶结构以及动态的微小变化，可以作为一种有效的常规检查方法，用于生产过程各个阶段的质量控制。Puchades等［24］应用该技术探索各种药物分子在血凝素上的主要抗原表位，并在药物开发的早期阶段确定候选药物。

HDX-MS 可作为筛选候选药物库、早期和晚期先导物优化的工具和蛋白质治疗药物生产中的常规质量控制方法［25］。它还可以揭示配体结合位点和诱导构象变化，为理解药物的定量构效关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）提供依据。该方法在单克隆抗体治疗的发展中贡献巨大，可作为一种可靠的方法来定位抗体-抗原在其固有溶液状态下的相互作用构象表位［26-28］，也被用于询问抗体偶联药物的高阶结构，以评估药物偶联过程如何影响单克隆抗体的构象和动力学特性［29］。Pan 等［30］首次将HDX-MS 应用于mAb和相应的抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）直接比较，以了解药物结合对ADC 的构象和动力学的影响，研究发现，ADC 和单抗在溶液中具有非常相似的构象和动力学参数，且HDX-MS 数据表明，药物偶联过程不会在蛋白质骨架上引起大规模的构象变化。

HDX-MS 有助于新药物的设计和发现，已用于单克隆抗体、抗体-药物偶联物和生物类似抗体的评估和开发［31］。

4.3 氢氘交换质谱法的优势

HDX-MS 可用于研究蛋白质中氢键网络和折叠，特别是当样本有限时，优势明显。HDX-MS 与其他方法相结合，如化学交联，有助于阐明单个蛋白质和大型蛋白质复合物的结构和构象动力学［32］。Yang 等［33］通过SPR 结合HDX-MS 技术对血清样本中存在的抗体进行了全面的定量和定性评估，SPR 技术提供抗体亲和力信息和抗原特异性抗体定量信息，MS提供血清抗体与其抗原之间结构相互作用信息，这对开发治疗性抗体或疫苗至关重要。Domina等［34］通过噬菌体结合HDX-MS技术确定了NHBA的结合位点。Rafalik等［35］通过HDX-MS 结合酶联免疫吸附试验揭示了抗原-抗体的亲和力和特异性的信息，以及表位信息。Calvaresi 等［36］通过尺寸排阻色谱结合HDX-MS 实现了从蛋白质-脂质系统中高效地在线去除脂质成分，在抗原表位定位期间耗尽抗原中的抗体，以及在HDX-MS 分析二硫键结合蛋白过程中消除MS 干扰化合物，如三（2-羧乙基）膦（TCEP）。它与低温电子显微镜（cryogenic electron microscope，Cryo-EM）有互补性，通过HDX-MS 测量分离和复合的蛋白质，可以揭示分子间相互作用如何影响其动力学和变构调节，低温电磁可能有助于解释HDX质谱的结果，尤其是当晶体学信息不可用时。

表位作图是识别参与抗原-抗体相互作用的结合位点的过程，表位的鉴定对于开发新的基于抗体的治疗和疫苗至关重要。揭示表位也有助于阐明靶蛋白的作用机制，HDX-MS 在表位定位方面的优势源于其高灵敏度和对蛋白质大小的极大耐受性，即使是大的蛋白质复合物，如组织相容性复合物，也可以通过表位作图鉴定［37］。Bereszczak等［38］应用HDX-MS 对病毒衣壳进行表位分析，并检测了两个重要的单克隆抗体片段FabE1 和Fab3120 以及乙型肝炎病毒衣壳中的核心抗原。Fernandez 等［39］利用HDX-MS 技术对乙型肝炎病毒、轮状病毒、登革热病毒和乙型脑炎病毒进行了表位作图，这表明HDX-MS 技术在病毒组装领域表位作图中有巨大的应用潜力。

5 化学交联质谱法

5.1 化学交联质谱法的原理

化学交联质谱法（chemical cross-linking mass spectrometry，CX-MS）的原理是对一个选定的蛋白质或蛋白质复合物在其自然状态下加入化学交联剂，交联剂可以共价连接空间上接近的氨基酸残基，其次交联蛋白被水解，生成的肽混合物被分离，并用LC-MS 进行分析。随后对MS 数据进行数据库搜索，以阐明交联肽的序列以及交联位点，交联位点可用于确定蛋白质单体或复合物的结构域和氨基酸侧链的邻近程度，识别蛋白质分子内或分子间潜在的结合位点。

5.2 化学交联质谱法的应用

CX-MS 主要应用于解析蛋白质结构和研究蛋白质间互作。解析蛋白质的结构对于了解蛋白质的功能具有重要作用，蛋白质功能的调控主要取决于其构象和相互作用的动态调节。有许多用于蛋白质-蛋白质界面结构表征的技术，如最常见的X 射线结晶学，该技术能够确定抗体与其抗原互作的精确位点，但X 射线结晶学对于蛋白质样品的纯度、浓度及结晶性等有严格的要求，不适合解析大分子蛋白质复合体的结构，且无法捕捉相互作用蛋白质的动力学［40］。CX-MS 能与蛋白质三维结构预测软件相结合从而确定蛋白质空间构象，能够固定弱/瞬时互作，以及帮助区分直接互作还是间接互作，确定蛋白质互作的界面［41］。

Chavez 等［42］演示了CX-MS 技术在鉴定组织样本中蛋白质结构特征和相互作用方面的应用，为小鼠心脏中存在的蛋白质复合物提供了系统结构生物学视角，每个确定交联肽对都提供了一个有用的分子探针，可用来量化组织中蛋白质构象或蛋白互作的变化，并可能帮助识别分子相互作用，作为线粒体靶向治疗心血管或其他疾病的新靶点。Huang 等［43］利用此方法探测了牛血清白蛋白的三维结构。CX-MS 也被广泛应用于蛋白质组的细胞裂解物、完整的细胞或细胞器、同时监测整个蛋白质组的PPIs 及其空间信息［44-45］。定量CX-MS 方法已被用于研究耐药癌细胞相互作用的信息，热休克蛋白90（Hsp90）和有丝分裂抑制剂诱导的蛋白质构象和相互作用的变化，以及拟磷酸化突变和核苷酸结合对Hsp90 与其辅伴侣Aha1 相互作用的影响［46］。定量CX-MS 将在可视化蛋白质结构和相互作用动力学中发挥越来越重要的作用［47］。

5.3 化学交联质谱法的优势

CX-MS 的日益普及很大程度上归因于它在结构生物学中作为一种整合方法，可创建更可靠的目标蛋白模型。许多技术可以与CX-MS 结合使用，如将不同的低分辨率方法结合，可以生成更精确的蛋白质和蛋白质复合物结构模型，特别是那些传统技术难以研究的结构［48］。

当CX-MS 与冷冻电镜和天然质谱结合使用时，这些空间约束数据可以指导分子建模，并绘制蛋白质复合物的动态行为图［49-50］。Courouble 等［51］通过将HDX-MS 与CX-MS 相结合，阐明了SARSCoV-2 全长nsp7：nsp8 复合物的结构动力学特征。Zhang等［52］成功地利用HDX-MS、CX-MS和分子对接技术确定了IL-7/IL-7Rα 结合界面，并预测了蛋白质-蛋白质复合物在溶液中的三维四级结构。此外，交联试剂可以共价连接两个或多个非共价相互作用的蛋白质，且与相互作用的时间和强度无关，因此即使是短暂的和弱的PPI 也可以被保留下来［53-54］。CX-MS 有助于确定交联氨基酸侧链的位置，从而将物理作用位点限制在特定的结构区域［55］。

6 展望

本文介绍了基于质谱的PPI 方法的一般原则及各种方法的优缺点，如表2 所示。质谱具有灵敏度高、可高通量检测等优点，采用质谱检测蛋白互作可在一定程度上弥补经典方法的局限性。基于质谱的方法检测的结构特征可以与传统的技术互补，如X 射线晶体学、电磁和核磁共振波谱学等。CX-MS 将会极大地推动生物大分子复合体结构和蛋白互作的研究。HDX-MS 技术不仅能够分析蛋白质的结构，还能分析结构动态变化，但设备条件限制了该技术在国内的应用，因此，提高数据自动解析度是HDX-MS技术推广的关键。未来HDX 质谱将继续在评估蛋白质治疗的高阶结构中发挥重要作用。相信更先进的质谱检测技术将更广泛应用于蛋白质互作领域。蛋白质复合物的组成及其互作表面、化学计量学、动力学等方面的研究将进一步提高这些技术在整合结构生物学中的应用价值。