植物乳杆菌对干腌马鲛鱼降盐增鲜效果的影响

梁进欣，陈晓红，李 珊，杨 娟,2，赵文红，白卫东,2,*

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；2.仲恺农业工程学院现代农业工程创新研究院，广东 广州 510225）

马鲛鱼是我国重要的经济鱼类，其肉质鲜美，且含有大量的蛋白质、多肽、氨基酸以及矿物质等营养物质，深受消费者喜爱。马鲛鱼不仅可以鲜食，还可以作为干腌制品，干腌马鲛鱼在我国的销量与消费潜力巨大。目前市面上的干腌马鲛鱼制作过程中通常加入大量食盐，以此降低产品水分含量与水分活度，抑制微生物的生长繁殖，从而达到延长马鲛鱼货架期的目的[1]。但高食盐的制作方式不仅会影响产品质量，而且对人体健康有一定的伤害，会引发高血压、心血管等慢性疾病[2]。因此，近年来在鱼的腌制过程中大多使用钾盐、钙盐等，以代替部分食盐[3-4]，但钾盐、钙盐等食盐替代物会使干腌鱼制品产生不良的滋味特性，如金属味与苦涩味[5]。

目前许多研究表明乳酸菌在食品生产中应用广泛，不仅能够抑制有害微生物的生长繁殖，还能够产蛋白酶，降解蛋白质，促进滋味物质的产生，如小分子肽、游离氨基酸等滋味物质[6]。滋味物质通常赋予食物鲜味、厚味等味感[7]，同时也具有咸味和增咸作用[8]，因此在鱼的腌制过程中，接种乳酸菌能起到降盐增鲜的效果，如游刚[9]发现乳酸菌不仅可改善干腌鱼的风味还能在腌制过程中减少食盐的用量；吴燕燕等[10]在鱼腌制后接种乳酸菌且降低用盐量，发现其鲜味氨基酸占比大于高盐组，说明乳酸菌促进了滋味物质的产生，同时也增强了产品的滋味特性；闫博文等[11]通过电子舌测定发现添加植物乳杆菌制作酸面团，其咸味强度高于空白组，认为其咸味与植物乳杆菌代谢形成的小分子肽有关。因此本研究以马鲛鱼为原料，腌制后接种植物乳杆菌制作干腌马鲛鱼，以经过4%（m/m）食盐与2%（m/m）食盐腌制处理的干腌马鲛鱼分别作为对照组1与对照组2，研究植物乳杆菌对干腌马鲛鱼的降盐增鲜作用，旨在为探究植物乳杆菌应用于马鲛鱼加工生产与产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马鲛鱼购于海南省海口市觉森商店；植物乳杆菌24258（Lactobacillus plantarum）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

5’-腺苷酸（adenosine 5’-monophosphate，5’-AMP）、5’-肌苷酸（inosine 5’-monophosphate，5’-IMP）、5’-鸟苷酸（guamosine 5’-monophosphate，5’-GMP）、肌苷（inosine，HxR）、次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx） 上海源叶生物试剂有限公司；氨基酸标准品及衍生试剂 安捷伦科技有限公司；细胞色素C（12 384 Da）、抑酞酶（6 511 Da）、氧化型谷胱甘肽（621 Da）和Gly-Gly-Gly（189 Da） 美国Sigma公司；其他试剂购自广州东巨生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SP-02型生化培养箱 黄石市恒丰医疗器械有限公司；DHG-9023A电热恒温鼓风干燥箱 上海培因实验仪器有限公司；CR-400色差仪 深圳市天友利标准光源有限公司；水分活度仪 深圳冠亚水分仪科技有限公司；FiveEasy Plus pH计 梅特勒-托利多公司；HWS-12电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；1260型高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司；5810型高速冷冻离心机 艾本德中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌马鲛鱼加工与取样

加菌组：按2%（m/m）加入食盐，均匀涂抹于鱼块表面，5 ℃静腌5 h，接种植物乳杆菌，菌液浓度108CFU/mL，接种量为10 mL/100 g，25 ℃静置发酵2 h，然后鱼块置于15 ℃生化培养箱干燥，干燥至鱼块水分质量分数为30%～35%，包装为成品。

对照组1：按4%（m/m）加入食盐，均匀涂抹于鱼块表面，5 ℃静腌5 h，腌制后的鱼块加无菌水，加水量为10 mL/100 g，置于25 ℃生化培养箱2 h，后鱼块置于15 ℃生化培养箱干燥，干燥至鱼块水分质量分数为30%～35%，包装为成品。

对照组2：按2%（m/m）加入食盐，其余同对照组1。

加工过程分5 个阶段取样：生肉、腌制期、干燥1 d、干燥3 d、干燥5 d，每个阶段取样后均用绞肉机绞碎，且置于－40 ℃冰箱保存。

1.3.2 基本理化指标的测定

水分含量的测定：参考GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》直接干燥法；水分活度的测定：参考GB 5009.238—2016《食品水分活度的测定》水分活度仪扩散法；pH值的测定：参考GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》；食盐含量测定：参考GB 5009.44—2016《食品中氯化物的测定》银量法；色度：用色度仪测定。

1.3.3 干腌马鲛鱼的感官评定

对13 名参与人员进行甜、苦、咸、鲜、厚味等味道的鉴别实验，组成感官评价小组，分别对两组干腌马鲛鱼的滋味进行评价（甜味、苦味、咸味、鲜味、厚味）。采用10 分制进行打分，然后取结果的平均值。每个评定员，独立评分，每品尝完一个样品，用蒸馏水漱口，再进行下一个样品的品尝。

1.3.4 核苷酸及其降解产物的测定

样品制备参照Ryder[12]的方法，准确称取5.00 g样品，加入15 mL 5%高氯酸溶液，重复均质3 次，10 000 r/min离心15 min，上清液过滤，用去离子水定容到25 mL，用1 mol/L KOH溶液调pH值至6.5，过0.22 μm水系滤膜，待测。色谱柱采用ZIC®-HILIC（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH 5.3），流动相B为纯乙腈；洗脱程序为V（A）∶V（B）=20∶80；等度洗脱；流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温30 ℃，检测波长254 nm。

1.3.5 游离氨基酸的测定

样品前处理参考Aro等[13]的方法略作修改：准确称取5.00 g样品，添加4%的三氯乙酸25 mL，重复均质3 次，10 000 r/min离心20 min，上清液过滤，用去离子水定容到50 mL，37 ℃水浴1 h后，用0.22 μm水系滤膜过滤。采用Agilent自动衍生进样程序，用高效液相色谱仪分析。

1.3.6 肽分子质量分布的测定

参考莫加利等[14]的方法略作修改：准确称取5.00 g碎肉，加入20 mL去离子水，重复匀质3 次，沸水浴提取120 min，8 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.22 μm水系滤膜，待测。色谱柱采用TSKGel-G2000-SWXL（7.8 mm×300 mm），流动相为0.1 mol/L磷酸盐溶液（pH 6.7），流速0.5 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，紫外检测波长214 nm。标准样品的相对分子质量对数值与洗脱体积拟合直线方程为y=－0.887 5x＋27.793（R2=0.976 8），其中y为标准肽相对分子质量的对数；x为保留时间/min。

1.3.7 滋味强度值（taste activity value，TAV）分析

TAV为样品中某呈味物质浓度与其味道阈值之比，若TAV大于1，则可以认为该物质对样品的滋味有重要贡献，若TAV小于1，则可以认为该物质对样品滋味贡献不明显[15]。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 22.0对数据进行方差分析及相关性分析，P＜0.05，差异显著；采用Origin 2018进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 干腌马鲛鱼加工过程中基本理化指标分析

从表1可知，在干腌过程中，干腌马鲛鱼的水分活度与水分含量呈显著的下降趋势。到干燥第5天，加菌组、对照组1、对照组2的水分活度和水分质量分数分别为0.83、0.86、0.86和33.92%、34.27%、34.86%，均达到保藏要求，且加菌组的水分活度显著低于对照组1、对照组2（P＜0.05），其原因可能是植物乳杆菌的活动加速产品的水分活度的降低及水分的流失[16]。在干腌过程中，微生物快速繁殖，分解鱼肉中的蛋白质、碳水化合物等，产生乳酸、乙酸等酸性代谢产物，pH值会逐渐降低。加菌组在干燥5 d pH值显著降低，达到5.85，由于植物乳杆菌能够大量产生乳酸等有机酸，而且作为优势菌，还能抑制腐败菌的生长繁殖[17]。在干腌过程中，由于水分不断散失与食盐的渗透作用，氯化物质量分数不断上升，从生肉0.09%上升到产品的5.02%（对照组1）、2.66%（对照组2）和2.58%（加菌组），样品含盐量均显著增加，但是由于加菌组与对照组2的食盐添加量均为对照组1的一半，因此最终产物中盐含量也低于对照组1。

2.2 干腌马鲛鱼加工过程中色差变化

从表2可看出，加菌组与对照组1、对照组2的亮度（L）、红度（a*）、黄度（b*）在加工过程有显著变化（P＜0.05），在腌制发酵过程中，鱼肉收缩，肌纤维间距减小，导致亮度变暗，而在干燥过程中，由于血红蛋白氧化，以及微量的美拉德反应等使鱼肉的色泽降低，从而鱼肉的亮度随着降低，红度上升[18]；而在腌制过程中，红度变为负值，可能是由于鱼肉表面的少量的肌红蛋白与食盐反应产生胆绿素[19]。鱼肉在干燥环境下，黄度升高，说明鱼肉脂肪氧化，在黄度上，加菌组与对照组1、对照组2没有明显差异。在干燥第5天加菌组样品的亮度、红度、黄度与对照组1、对照组2没有明显的差异（P＞0.05），说明植物乳杆菌的添加对干腌马鲛鱼的外观品质无显著影响。

表1 干腌马鲛鱼加工过程中水分含量、水分活度、pH值、盐含量的变化Table 1 Changes in water content, water activity, pH and salt content of dry-cured mackerel at different processing stages

表2 干腌马鲛鱼加工过程中色差变化Table 2 Changes in color parameters of dry-cured mackerel at different processing stages

2.3 干腌马鲛鱼的味觉特性分析

为确定干腌马鲛鱼基本味感特性，将3 组干腌马鲛鱼隔水蒸煮，并且进行感官评价。如图1所示，咸、鲜、厚味是干腌马鲛鱼主要的味觉特性，加菌组与对照组1、对照组2的味觉特性有明显差异。加菌组与对照组2的干腌马鲛鱼只添加了2%食盐，其氯化物质量分数分别为2.66%与2.58%，但加菌组的咸味、鲜味、厚味均高于对照组1与对照组2，说明植物乳杆菌有较好的增咸、增鲜效果。植物乳杆菌能够产生蛋白酶，促进蛋白质分解成小肽与氨基酸。小肽与氨基酸是干腌马鲛鱼主要的呈味物质[20-21]，因此可以推测，植物乳杆菌的添加有利于干腌马鲛鱼中呈味物质的产生，尤其是咸味、鲜味和厚味物质。

图1 干腌马鲛鱼感官评定雷达图Fig. 1 Radar chart for sensory evaluation of dry-cured mackerel

表3 干腌马鲛鱼加工过程中游离氨基酸含量的变化Table 3 Changes in free amino acid contents in dry-cured mackerel at different processing stages mg/100

2.4 干腌马鲛鱼加工过程中游离氨基酸含量的变化与TAV分析

游离氨基酸是干腌鱼中典型的滋味物质，其种类及含量能够改善干腌鱼的口感，提高味感。从表3可知，样品经过干腌后，其游离氨基酸含量均显著增加，而加菌组增幅显著高于对照组1、对照组2（P＜0.05），到干燥5 d其总游离氨基酸是对照组1与对照组2的1.3、1.5 倍。其中，鲜味氨基酸与甜味氨基酸的含量与占比均高于对照组1，而苦味氨基酸的占比则低于对照组1与对照组2，说明植物乳杆菌的添加，有利于产品鲜、甜味氨基酸的产生，降低苦味氨基酸的占比，提高了产品的整体滋味。

图2 干腌马鲛鱼游离氨基酸的TAVFig. 2 TAV of free amino acids in dry-cured mackerel

从图2可知，甜味氨基酸中，只有甲硫氨酸的TAV大于1，其余的甜味氨基酸的TAV均小于1，高浓度的咸味会抑制甜味，而且鲜味物质对甜味有一定的抑制作用[22]，Kemp等[23]发现高浓度的谷氨酸钠能够抑制甜味的呈现，因此在干腌马鲛鱼的感官评定中，甜味不是主要的味感。对照组1与对照组2中鲜味氨基酸的TAV均小于1，对鲜味的贡献不大，而加菌组中虽然天冬氨酸的TAV低于1，但谷氨酸的TAV接近1.5，对干腌马鲛鱼的鲜味贡献极大，更好地促进加菌组干腌马鲛鱼的鲜味味感的呈现。许多研究表明谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸能够增强咸味味感，属于咸味或增咸氨基酸[24-26]，因为谷氨酸与天冬氨酸能够与氯化钠产生协同增效作用，不仅能增强鲜味强度[27]，还能增强咸味强度，Rocha等[28]发现谷氨酸能够在低浓度的氯化钠溶液中表现出增强咸味的能力，而且比GMP、IMP的增咸能力更强；Jinap等[25]发现在辣汤中加入0.7%味精可以降低32.5%的钠添加量；而精氨酸、赖氨酸尽管是苦味氨基酸，但也具有增强风味的能力，在一定程度上能够提高产品的咸味强度[26]，Toelstede等[26]在奶酪蛋白的感官重组实验中发现缺乏精氨酸的实验组其咸味强度降低了0.6 个单位；而且苯丙氨酸和酪氨酸等苦味氨基酸在低于其阈值时也能增加干腌马鲛鱼的呈味复杂性，并适当提高咸味与鲜味强度[29-30]。因此通过干腌马鲛鱼的游离氨基酸含量及其TAV分析，加菌组样品的鲜味氨基酸、咸味及增咸氨基酸的TAV均高于对照组1与对照组2（P＜0.05），因此其咸味与鲜味强度与图1干腌马鲛鱼味感特性评价相符。

2.5 干腌马鲛鱼肽分子质量分布分析

从图3可知，对照组1中＜5 kDa的小分子肽段高于对照组2，说明4%食盐腌制比2%食盐腌制更好地增强鱼内组织蛋白酶的活性，促进鱼肉蛋白的分解，该结果与表3总游离氨基酸含量结果相符，其原因可能是由于在一定范围内适度的高盐腌制可增强组织蛋白酶活性[31]。加菌组样品中呈味小分子肽段（＜5 kDa）[32-33]占比显著高于对照组1、对照组2（P＜0.05），其中加菌组＜1 kDa的肽段占比为21%，是对照组1、对照组2的1.5、3 倍，此肽段区间是鲜、厚味富集区域[34]，说明植物乳杆菌的添加有利于鲜、厚味肽的产生，而大部分的鲜、厚味肽具有一定的增鲜、增咸的作用[33]，可以提高产品的整体风味，而这些肽段里是否含有咸味肽则需要进一步的研究。因此可推测加菌组样品中含有较多的鲜味肽、厚味肽，进一步证明其鲜味、咸味、厚味强度与图1吻合。

图3 干腌马鲛鱼的肽分子质量分布Fig. 3 Molecular mass distribution of peptides in dry-cured mackerel

2.6 干腌马鲛鱼加工过程中的核苷酸含量的变化

核苷酸中AMP、IMP、GMP是典型的鲜味剂，在食物中广泛存在，核苷酸的代谢途径为ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx）[35-36]。从表4可知，在生肉中检测鲜味物质AMP、IMP分别是10.51、247.37 mg/100 g，GMP未检出。而在腌制时期，加菌组与对照组1、对照组2均检出AMP、IMP，但加菌组的IMP含量显著低于对照组1与对照组2，可能是植物乳杆菌加快了IMP的代谢；到干燥5 d，加菌组与对照组1、对照组2都未检出鲜味核苷酸，而Hx在干腌过程中的含量不断升高，可能由于内源酶与微生物酶的作用，核苷酸已全部降解为HxR和Hx。加菌组样品中的苦味核苷酸含量（Hx、HxR）显著高于对照组1、对照组2，及其部分苦味氨基酸的TAV大于1，特别是组氨酸，其TAV高达3.3，对苦味强度有一定的提高，而对照组1样品中食盐含量较高，可能在一定程度上掩盖苦味，与图1感官评价结果吻合。

表4 干腌马鲛鱼加工过程中核苷酸含量的变化Table 4 Changes in nucleotide contents in dry-cured mackerel at different processing stages mg/100 g

3 结 论

通过对干腌马鲛鱼的基本理化指标与色度测定，得出加菌组的水分活度与pH值显著低于对照组1、对照组2（P＜0.05），腌制后接种植物乳杆菌有利于干腌马鲛鱼的保藏，对色泽的影响不显著，不影响干腌马鲛鱼的外观品质。经过感官评价与呈味物质的比较分析，加菌组样品鲜味、咸味、厚味都优于对照组1、对照组2，特别在咸味特性中，加菌组只添加2%食盐，咸味强度却高于对照组1，证明植物乳杆菌在一定程度上能促进干腌马鲛鱼中鲜味、厚味及增咸物质的产生。加菌组的鲜味氨基酸TAV和＜1 kDa肽占比显著高于对照组1与对照组2（P＜0.05），由于鲜味氨基酸与＜1 kDa的肽段本身具有鲜味、厚味等味感，而且也具有一定的增咸作用，因此加菌组样品的鲜味、咸味、厚味强度与感官评定的结果相符，证明植物乳杆菌的添加可以降低干腌制品中食盐的添加，同时还可以增加干腌制品的鲜味、咸味及厚味等味感，有较好的降盐增鲜效果。本研究探讨植物乳杆菌对干腌马鲛鱼的降盐增鲜效果，为植物乳杆菌应用于干腌制品的工艺改良、产品开发与滋味研究提供一定的理论支撑。