血清外泌体miRNAs在晚期胃癌患者化疗疗效预测中的价值*

孙婧悦 王啸 王振欣 徐红

作者单位：①苏州大学附属第一医院肿瘤科（江苏省苏州市215006）；②苏州大学附属第二医院骨科

胃癌是消化系统高发的恶性肿瘤之一，由于起病隐匿，多数患者确诊时已失去手术根治的机会，对于这部分胃癌患者，化疗成为主要的治疗手段[1]。然而肿瘤细胞对化疗药物耐药是导致治疗失败的重要原因[2]。目前尚无确切的预测胃癌化疗疗效的标记物，因此，探究胃癌化疗疗效相关的预测分子具有重要的临床意义。外泌体与肿瘤化疗疗效的相关性是近年来的研究热点，外泌体通过向邻近细胞传递miRNAs、mRNAs 等功能小分子，在肿瘤微环境中发挥重要的作用[3]。有报道显示，耐药细胞的外泌体，可以通过传递miRNAs赋予敏感细胞耐药性，从而影响化疗的疗效[4]。为了探究外泌体miRNAs 预测胃癌化疗疗效的可能性，本研究通过对晚期胃癌患者血清外泌体miRNAs的筛选及验证，初步探讨差异表达显著的外泌体miRNAs在化疗疗效预测中的价值，以期为实现胃癌患者的个体化治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集苏州大学附属第一医院2018年4月至2020年11月确诊为胃腺癌Ⅳ期的36例患者病例资料，其中12例有肝脏单发或多发转移、4例骨转移、3例肺转移、17例腹盆腔转移；男性28例、女性8例；年龄32～80 岁，高、中、低分化分别为6、11、19例；肿瘤位于胃底贲门13例、胃体11例、胃窦12例。美国东部肿瘤协作组（ECOG）评分[5]：36例患者中1分32例，2 分4例。均符合以下标准：1）年龄≥18 岁，ECOG 评分≤2 分，预计生存期≥3 个月；2）经病理学诊断证实为胃腺癌；3）既往未接受过化疗和（或）放疗的初治Ⅳ期患者；4）HER-2 检测为阴性；5）根据实体肿瘤疗效评价标准（RECIST），有可以进行测量的病灶；6）心脏、肝脏、肾脏等重要脏器功能正常；7）接受不少于2 个周期的化疗，具体化疗方案包括Xelox（奥沙利铂130 mg/m2静滴，d1+卡培他滨1 000 mg/m2，口服，每日2 次，d1～14）和SOX（奥沙利铂130 mg/m2静滴，d1+替吉奥40 mg/m2口服，每日2 次，d1～14），21 天为一个化疗周期；8）每周期化疗前1 周内血常规：白细胞计数≥4.0×109/L，中性粒细胞计数≥2.0×109/L，血小板计数≥100×109/L。以上所有研究内容均经患者知情同意。

1.2 方法

所有Ⅳ期胃癌患者接受每2 个周期的Xelox 或SOX方案化疗后，按照RECIST 评价方法[6]对可测量病灶进行疗效评价。完全缓解（complete response，CR）：所有目标病灶全部消失；部分缓解（partial response，PR）：基线病灶最大径之和缩小≥30%；疾病进展（progressive disease，PD）：基线病灶最大径之和增加>20%，或有新的病灶出现；疾病稳定（stable disease，SD）：基线病灶最大径之和介于 PR和PD 之间。化疗敏感组为CR+PR 病例，化疗耐药组为SD+PD 病例。对于已获得CR 或PR的病例，在至少4 周后再次对肿瘤病灶进行测量，若持续CR 或PR，才被证实CR或PR。

1.3 血清样本收集及外泌体提取

收集胃癌患者首次用药前的清晨空腹全血，室温下离心，转速为4 000 rpm，15 min，取上清于-80℃冰箱中保存，用于后续研究。取上述血清1 mL，加入外泌体分离试剂250 μL。混匀后置于4℃，转速3 000 rpm离心20 min，静置2 h。沉淀用100 μL 1×PBS 重悬，即外泌体。

1.4 血清外泌体的鉴定

1.4.1 电镜观察外泌体的形态 吸取10 μL 外泌体于990 μL的PBS 溶液中，充分混匀，再次吸取稀释后的样品20 μL，滴加到电镜铜网上，10 min 后将铜网侧面的液体吸干，加入10 μL 浓度为20 g/L 磷钨酸于铜网上，室温下负染1 min，继续吸干多余的液体，晾干后将铜网放于槽中使用透射电镜观察。

1.4.2 Western blot 检测外泌体标志蛋白的表达 收集提取的外泌体，加入200 μL RIPA 裂解液，提取外泌体蛋白质，使用BCA 蛋白浓度试剂盒检测蛋白浓度，随后进行SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白、转膜、封闭、洗涤等步骤，将膜与一抗稀释液孵育（1∶50 000稀释的抗CD9 抗体、1∶20 000 稀释的CD63 抗体、1∶2 000 稀释的CD81 抗体），4℃过夜，TBST 洗涤3 次，再加入1∶15 000 稀释的相应二抗室温轻摇孵育，洗涤3 次后，参照ECL 化学发光试剂盒的说明书步骤，进入暗室显影条带。

1.5 血清外泌体总RNA的提取及miRNAs 测序

从化疗敏感组及化疗耐药组中，各随机抽取5例患者的血清，按照外泌体RNA 提取试剂盒说明书提取血清外泌体RNA，将获得纯化的miRNAs，送上海康成生物公司行文库构建及测序分析，筛选出两组差异表达倍数>2（P<0.01）的外泌体miRNAs。

1.6 实时荧光定量PCR 检测miRNAs 表达

取2 μL 血清外泌体总RNA 样品，按照逆转录试剂盒操作说明书，在10 μL 反应体系内逆转录成cDNA，反应条件为42℃ 15 min，95℃ 3 min，于-20℃保存。取2 μL cDNA 模板，在20 μL 反应体系内行PCR 反应，预变性95℃ 10 min 1 个循环，变性95℃ 10 s，退火延伸60℃ 20 s。于LightCycler 480 荧光定量PCR仪扩增 40 个循环后，收集熔解曲线数据。引物序列见表1，每个样本重复检测3 次，取平均值作为结果。

表1 miRNAs 引物序列

1.7 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。分类变量比较采用卡方检验；研究中的数值均以均数±标准差表示，计量资料比较采用t检验；采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）评价晚期胃癌患者血清外泌体中，miRNA-106a-5p、miRNA-1 323、miRNA-202-3p在化疗疗效预测中的价值。所有统计结果均为双侧检验，检验标准设定α=0.05，以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 化疗疗效与临床病理因素的关系

按照RECIST 评价标准对36例IV 期胃癌患者进行疗效评价，同一患者化疗前后使用同一种影像学方法评估，其中CR 0例、PR 15例、PD 7例、SD 14例，将CR+PR 归为化疗敏感组（0例+15例），PD+SD 归为化疗耐药组（7例+14例）。对化疗疗效与Ⅳ期胃癌患者的临床病理特征进行分析，其中敏感组年龄（58.3±14.5）与耐药组年龄（60.8±9.2）无统计学差异（P>0.05），化疗疗效与患者的性别、分化程度、病变部位、远处转移部位及ECOG 评分均无关（P>0.05，表2）。

表2 化疗疗效与胃癌患者临床病理因素的相关性

2.2 胃癌患者血清外泌体鉴定结果

胃癌患者血清外泌体提取后，通过透射电镜观察形态（图1A）：呈囊泡状，直径为50～150 nm，形态基本相似，为椭圆形，呈现双层膜的结构。囊泡边缘电子密度较高，颗粒感明显。本研究采用Western blot 检测外泌体标记物表达，以进行外泌体鉴定。结果提示血清外泌体特异性蛋白CD9、CD63、CD81 表达显著升高（图1B）。

2.3 胃癌患者血清外泌体miRNAs 测序结果

对敏感组及耐药组患者的血清样本，进行外泌体miRNAs 测序分析：Fold change>2 代表差异表达，在耐药患者外泌体和敏感患者外泌体中，表达差异显著的miRNAs 共527 个，其中耐药组中表达上调的miRNAs 361 个，表达下调的miRNAs166 个。如聚类分析图（图2A）所示：红色条带代表miRNAs在耐药血清中表达升高，绿色代表在耐药血清中表达降低的miRNAs。最终筛选出差异性表达最显著的10 个miRNAs（图2B）：其中miRNA-106a-5p、miRNA-1323、miRNA-202-3p、miRNA-421、miRNA-133a-5p 表达上调，miRNA-877-5p、miRNA-337、miRNA-212、miRNA-28-3p、miRNA-144 表达下调。

2.4 qRT-PCR 定量验证血清外泌体miRNAs

选取上调的5 个miRNAs 作为研究对象，设计其上下游引物，并在36例胃癌患者血清中行qRT-PCR检测进行验证，结果提示miRNA-106a-5p、miRNA-1323、miRNA-202-3p在耐药患者血清外泌体中的表达较敏感患者显著上调（P<0.01，P<0.01，P<0.01，图3），其余2 个miRNAs的表达在两组中无显著性差异，予以剔除。

2.5 验证后的miRNAs 预测化疗疗效的价值

化疗耐药的胃癌患者血清外泌体的miRNA-106a-5p、miRNA-1 323、miRNA-202-3p 表达显著高于化疗敏感患者（图4）。miRNA-106a-5p在预测晚期胃癌化疗疗效的敏感性、特异性及曲线下面积分别为90.5%、93.3%、0.952。miRNA-1 323在预测晚期胃癌化疗疗效的敏感性、特异性及曲线下面积分别为90.1%、86.7%、0.949。miRNA-202-3p在预测晚期胃癌化疗疗效的敏感性、特异性及曲线下面积分别为85.7%、93.1%、0.946。

3 讨论

手术联合化疗是根治胃癌最重要的手段，但多数患者在确诊时已无法施行手术，因此对于晚期胃癌，化疗成为延缓肿瘤进展、延长患者生存期最重要的治疗手段[7]。以氟尿嘧啶类联合铂类药物联合化疗方案在中国的晚期胃癌临床化疗应用中更为推荐[8]。患者对化疗药物耐药是疗效不佳的重要原因，因此，寻找疗效预测的相关分子标志物有着重要的临床意义。

外泌体是细胞主动分泌的直径为30～100 nm的膜囊泡，稳定存在于血液、尿液、脑脊液及细胞培养液中。外泌体通过向邻近细胞传递miRNAs 等功能小分子，在细胞间信息交流中发挥重要的作用[9]。有研究发现，耐药细胞可以将包裹miRNAs的外泌体释放到肿瘤微环境中，从而赋予受体细胞耐药性[4]。Rhim等[10]通过构建吉西他滨耐药的胰腺导管癌细胞，提取其外泌体发现miRNA-155 表达上调。外泌体中大量miRNA-155 会导致细胞凋亡抑制，最终引起胰腺癌细胞对吉西他滨耐药。Yang 等[11]在胃癌顺铂耐药细胞外泌体中，检测miRNA-21 表达，发现其表达水平显著上调，而抑制miRNA-21的表达，可促进胃癌细胞凋亡，显著改善胃癌耐药细胞对顺铂的敏感性。因此，外泌体miRNAs 有望成为肿瘤化疗疗效预测的新型分子标志物。

本研究共收集了36例接受SOX 或Xelox方案化疗的Ⅳ期胃癌患者的病例资料及患者初次化疗前的血清样本，根据RECIST 标准分为敏感组和耐药组。提取外泌体并进行外泌体miRNAs 测序分析，共筛选出527 个表达差异的miRNAs，其中耐药组中表达上调的miRNAs 361 个，下调的miRNAs166 个。由于上调的miRNAs 数量显著高于下调的miRNAs，且差异表达的倍数越高，则预测价值越大[12]。因此，本研究选取了在耐药组中表达上调最显著的5 个miRNAs，并通过qRT-PCR 进行验证，结果提示仅有3 个miRNAs 具有疗效预测的价值。miRNA-106a-5p、miRNA-1 323、miRNA-202-3p 均在胃癌中有报道，Dong 等[13]研究发现，LncRNA GAS5 过表达通过Akt/mTOR 途径吸附miRNA-106a-5p 抑制胃癌的发生发展；榄香烯通过调节miRNA-1 323/EGFR 信号轴抑制多药耐药胃癌细胞的转移[14]；miRNA-202-3p在胃癌细胞MKN-28和BGC-823 中过度表达，显著抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[15]。

综上所述，本研究通过对化疗敏感组和化疗耐药组的血清外泌体miRNAs 测序分析及验证，筛选出miRNA-106a-5p、miRNA-1 323和miRNA-202-3p在晚期胃癌疗效预测中有一定的价值。提示对于初治的晚期胃癌患者，化疗前检测血清miRNAs 以预测化疗疗效，能够指导化疗方案的制定，减少耐药的发生。本研究仍存在一定的局限性，如外泌体的鉴定采用标记物检测及电镜观察，缺乏粒径分析结果；本研究为单中心小样本研究，后续将继续扩大样本量，深入探究miRNA-106a-5p、miRNA-1 323和miRNA-202-3p的下游靶基因及信号通路，为晚期胃癌的疗效预测提供新的思路。