丝状支原体山羊亚种LppA蛋白N末端基因真核表达载体构建及小鼠免疫效果分析

尹德晶，吴 燕，岳 筠，杨 鹏，陈 静，王 慧，张双翔，王开功,2*，程振涛,2*

(1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵阳 550025；3.贵州省动物疫病预防控制中心，贵阳 550008)

丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.capri，Mmc)会引起山羊肺炎、乳腺炎、关节炎、角膜炎和败血症等，主要引起山羊发生肺炎，感染羊表现为严重呼吸窘迫、发热、黏液性鼻液和死亡，可侵害不同年龄、性别的山羊，发病率为45%～90%，死亡率为14%～50%[1-2]。Mmc和绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)均可引起羊支原体肺炎(mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPSG)，据流行病学调查显示，Mmc是引起山羊支原体肺炎的病原之一[3]，Mmc具有广泛的地理分布性，只感染山羊且致病性强于Mo，由于贵州省当前大力发展养羊业，育有贵州黑山羊、贵州白山羊、黔北麻羊等优秀地方品种，必须重视Mmc的危害[4-5]。

当前对Mmc的研究主要集中于菌株的分离鉴定[6]、基因序列分析[7]及检测方法的建立[8]，对如何阻断Mmc传播的研究仍然是空白，Mmc虽然致死率不高，但感染羊的精液或者乳制品质量下降，并且通过精液和乳汁传播该病，感染严重的羊甚至发生流产[9]。因此，急需找到防控Mmc传播的手段，本研究基于Mmc贵州株的LppA蛋白N末端基因通过分子生物学技术构建真核重组表达质粒pVAX1-LppA，以期作为DNA疫苗有效防控羊支原体肺炎。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞及动物

大肠杆菌感受态细胞DH5α、pMD19-T-LppA克隆质粒、真核表达载体pVAX1、MDBK细胞、羊源LppA蛋白、Mmc贵州株均由贵州大学预防兽医学实验室提供；Mmc羊源阳性/阴性血清来源为中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠间接血凝试验(IHA)阳性血清/阴性血清，4～5周龄BALB/c小鼠购自贵州医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂

限制性内切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ、LipofecttamineTM3000、无内毒素质粒大、小量提取试剂盒购自Invitrogen公司；白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、干扰素-γ(IFN-γ)检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；兔抗羊IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP、兔抗羊IgG-FITC均购自上海碧云天生物技术有限公司；PE标记CD4+抗体、CY5标记的CD8+抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 重组质粒pVAX1-LppA构建

结合Mmc标准株PG3(登录号：NZ_JFAE01000018.1)LppA基因序列和pVAX1载体酶切位点，设计一对特异性引物(F:5′-AAGCTTACCACCATGAGTTTGCAAGAAACAGACAAAGATG-3′,R:5′-CTCGAGCTATCCCCTAGAATCAATACCAAAATC-3′，下划线示酶切位点)，预扩期增片段为450 bp，PCR扩增LppA基因片段，胶回收目的基因并纯化，用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对pVAX1载体和纯化产物进行双酶切，T4连接酶连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，通过重组质粒PCR、双酶切及测序进行鉴定。

1.4 重组质粒pVAX1-LppA体外表达鉴定

经无内毒素质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA并测定浓度，将转染试剂、质粒按照比例混合制备脂质体，室温稳定15 min，转染至长至80% MDBK细胞的6孔板中，同时设置空载体pVAX1转染组和未转染空白对照组，转染48 h后，提取重组质粒pVAX1-LppA组和空载体pVAX1组细胞RNA，反转录为cDNA，RT-PCR方法扩增LppA基因，检测其转录水平。以Mmc阳性血清为一抗，FITC-兔抗羊IgG为二抗，对pVAX1-LppA组、空载体pVAX1对照组以及空白对照组MDBK细胞分别进行间接免疫荧光检测(IFA)。

1.5 动物免疫试验

1.5.1 小鼠分组与免疫 为评价重组质粒pVAX1-LppA的免疫效果及最佳接种剂量，试验选用100只6周龄BALB/c小鼠，随机分为5组，每组20只，分别于肌肉接种无菌PBS 100 μL、空载体pVAX1 100 μg、重组质粒pVAX1-LppA50 μg、重组质粒pVAX1-LppA100 μg、重组质粒pVAX1-LppA150 μg，首次免疫后每间隔1周以相同途径、剂量加强免疫，共免疫3次。

1.5.2 血清抗体水平检测 免疫后连续8周采集小鼠血清样本，用LppA蛋白(0.2 μg·mL-1)包被酶标板、3%BSA封闭、加入待检样本(1∶50稀释)、HRP-羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)作为二抗标记、显色后用酶标仪检测样本OD630 nm值以检测特异性抗体水平。

1.5.3 细胞因子分泌水平测定 为了评价血清中细胞因子的水平，免疫后连续8周采用ELISA试剂盒分别检测血清中IL-2、IL-4和IFN-γ 3种细胞因子水平，根据标准曲线计算各细胞因子含量。

1.5.4 脾淋巴细胞增殖检测 免疫后连续8周每组随机取2只小鼠，无菌分离脾淋巴细胞，细胞计数调整细胞悬液浓度为104cell·mL-1，取96孔板每孔接种100 μL细胞悬液，试验组每孔再加入50 μL刀豆素(ConA 25 μg·mL-1)、空白组加入等体积细胞培养液，5% CO2、37 ℃培养48 h后，每孔加入10 μL噻唑蓝溶液(MTT 5 mg·mL-1)，继续孵育4 h，每孔加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)培养1 h后测OD490 nm值。

1.5.5 脾T淋巴细胞亚群检测 流式染色缓冲液调整脾淋巴细胞为107cell·mL-1，通过流式细胞术分选CD3+、CD4+T淋巴细胞和CD3+、CD8+T淋巴细胞，并以PE-CD4+和CY5-CD8+细胞抗体检测CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞分别占总细胞数的比例。

1.6 攻毒保护性试验

末次免疫后第14天，每组随机取5只小鼠分别接种Mmc菌液(1×108CCU·mL-1)，攻毒后进行隔离饲养，每日观察并记录攻毒后小鼠的临床症状，攻毒后第14天处死所有小鼠并解剖，通过眼观和病理切片观察肺病理变化，并以采食下降、精神沉郁等临床症状为感染标准，统计分析重组质粒pVAX1-LppA的攻毒保护效果。

1.7 统计分析

2 结 果

2.1 重组质粒pVAX1-LppA构建

将LppA基因片段连至真核载体pVAX1，提取重组质粒进行PCR和双酶切鉴定。重组质粒PCR扩增出现450 bp大小目的条带，空白对照无条带(图1)；双酶切呈现两条DNA带，即载体条带(2 999 bp)和目的条带(450 bp)，空载体对照只有载体条带2 999 bp(图2)。并将PCR和双酶切鉴定均为阳性的重组质粒送往生物公司测序，测序结果经过比对正确，提示pVAX1-LppA重组质粒构建成功。

M.2 000 bp DNA相对分子质量标准；1～3.重组质粒pVAX1-LppA；4.PCR对照；-.空白对照

M.1 kb-Ⅳ DNA相对分子质量标准；1～3.重组质粒pVAX1-LppA；4.PCR对照；5.空载体对照

2.2 重组质粒pVAX1-LppA体外表达鉴定

RT-PCR方法检测结果显示pVAX1-LppA转染MDBK细胞后，可扩增到大小为450 bp目的条带(图3)，而空载体对照组未扩增出条带，提示目的基因转录mRNA的存在。采用间接免疫荧光方法检测重组质粒的表达情况，转染pVAX1-LppA组可见绿色荧光，空载体对照组未见绿色荧光，提示构建pVAX1-LppA可在MDBK细胞内有效表达(图4)。

2.3 免疫小鼠血清抗体检测

在免疫重组质粒pVAX1-LppA后14 d内未发现试验小鼠有任何临床异常现象，通过间接ELISA方法对采集的不同时间点各组小鼠血清进行特异性抗体检测。结果如图5，pVAX1-LppADNA疫苗组小鼠血清中抗体水平均在免疫后1周显著提高并在7周内保持较高水平，且均显著高于PBS和空载体对照组，但不同剂量组间抗体水平无差异。

字母一致或ns表示差异不显著(P>0.05)，字母不一致表示差异显著(P < 0.05)；样本OD630 nm值≥2.325时为阳性；样本OD630 nm值<2.325时为阴性。下图同

2.4 IL-2、IL-4和IFN-γ分泌水平检测

采集不同时间点的各组小鼠血清样本，应用细胞因子ELISA检测试剂盒检测血清中IL-2、IL-4、IFN-γ细胞因子含量。结果如图6所示，与PBS和空载体pVAX1对照组相比，免疫重组质粒pVAX1-LppA(50、100、150 μg)的小鼠血清中细胞因子分泌水平均显著升高，在免疫后第4周达到巅峰后略有下降，但整体维持在较高水平，重组质粒pVAX1-LppA的免疫剂量不同对细胞因子分泌水平影响不显著，提示重组质粒pVAX1-LppA可以提高细胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)分泌水平，增强机体免疫应答。

图6 小鼠血清中IL-2(A)、IL-4(B)和IFN-γ(C)分泌水平检测结果

2.5 脾淋巴细胞增殖检测

利用MTT比色法检测不同时间各组小鼠脾淋巴细胞增殖情况，结果见图7，在免疫后1周重组质粒pVAX1-LppA组小鼠脾淋巴细胞增殖速度加快，2～6周均显著高于对照组，免疫后2周达到巅峰维持3周后缓慢下降，7周时仍保持较高水平并显著高于对照组，其中pVAX1-LppA(100 μg)组小鼠脾淋巴细胞增殖能力显著高于其余两个剂量组。

图7 小鼠脾淋巴细胞增殖检测结果

2.6 脾T淋巴细胞亚群检测结果

流式细胞仪检测小鼠脾淋巴细胞中T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+T淋巴细胞)占总细胞数的比例。结果见图8，PBS组、空载体组、pVAX1-LppA50 μg组、pVAX1-LppA100 μg组、pVAX1-LppA150 μg组CD4+T淋巴细胞百分比分别为9.7%、9.8%、12.3%、21.7%、14.9%，CD8+T淋巴细胞的百分比分别为5.1%、5.2%、7.8%、8.9%、8.1%，pVAX1-LppA组CD4+、CD8+T淋巴细胞数量显著高于对照组，提示pVAX1-LppADNA疫苗可引起免疫反应，其中CD4+T细胞较CD8+T细胞比重更大。

图8 免疫小鼠T淋巴细胞CD4+、CD8+T淋巴细胞占总细胞的变化情况

2.7 攻毒保护性试验结果

人工感染Mmc后，PBS和空载体pVAX1对照组小鼠均出现精神沉郁、食欲下降等临床症状判定为发病，保护率为0%，免疫pVAX1-LppA(50、100、150 μg)组部分小鼠出现临床症状，保护率分别为40%、80%、60%，发病小鼠数量明显少于对照组，其中免疫pVAX1-LppA(100 μg)小鼠保护率最高为80 %(表1)。取人工感染后各组小鼠的肺进行病理切片观察，结果如图9，PBS和空载体pVAX1对照组肺泡出现融合性病灶，肺泡壁断裂，肺泡结构退化或消失，渗出大量炎性细胞；pVAX1-LppA(50、100、150 μg)组症状明显减轻，炎性渗出物减少，肺泡结构相对比较完整。

表1 小鼠Mmc攻毒保护结果

3 讨 论

丝状支原体山羊亚种是引起我国山羊支原体性肺炎的病原之一，传染性较强，危害严重，给不同品种山羊大规模养殖带来严重的防控挑战[10]。由于支原体的培养困难，培养周期长、营养要求高，导致传统疫苗研究进展缓慢，目前尚未有针对防控此病原感染的相关疫苗，所以临床上养殖户们常选用喹诺酮类、大环内酯类等药物控制该病，但药物无法根除病原且只在初次感染有一定作用，发生耐药性、药物残留等情况也屡见不鲜，因此，为解决目前传统疫苗研究的困境，急需研制一种安全有效的疫苗[11-12]。

随着生物技术的发展，亚单位疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、活载体疫苗等新型疫苗逐渐引领当前疫苗研究的新风向，较传统疫苗新型疫苗具有易于构建、免疫原性和生物安全稳定性更高等优点[13-14]。结合前期对MmcLppA基因的生物信息学分析，发现LppA基因N末端的B细胞表位区域较大且稳定，是优势抗原表位的潜在区域，张玲等[15]构建LppA重组原核表达质粒pET-LppA证明LppA具有良好的免疫原性，因此本研究针对引起山羊支原体肺炎的主要病原Mmc，基于Mmc的LppA 蛋白N末端基因研制DNA疫苗，并分析其免疫效果。

高水平体液和细胞免疫反应被认为是疫苗介导最有效的免疫反应，但不同种类疫苗的免疫效果存在差异，灭活疫苗主要激活宿主产生高水平的体液免疫应答，基因工程疫苗可同时刺激机体的体液和细胞免疫[16-17]。IFN-γ和IL-2主要由Th1型细胞分泌，IFN-γ是细胞免疫应答的标志，IL-2是一种T细胞生长因子，参与抗原特异性T细胞和CD4+T细胞的克隆性扩增，促进CD4+T淋巴细胞大量增殖[18]，CD4+T细胞和CD8+T细胞协同T细胞抗原受体激活细胞免疫应[19]，但CD8+T细胞在某些趋化因子诱导具有抑制作用[20]。本研究发现pVAX1-LppADNA疫苗免疫小鼠后血清中细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平和CD4+、CD8+T细胞占总细胞数的百分比均高于对照组，且CD4+T细胞的占比高于CD8+T细胞，提示pVAX1-LppADNA疫苗对机体的保护作用是由T细胞介导的，并且主要以CD4+T辅助淋巴细胞为主。IL-4是Th2型细胞因子，通过刺激记忆B细胞增殖、分化成浆细胞分泌抗体，参与调控体液免疫[21]，结果表明在免疫pVAX1-LppADNA疫苗后血清中Mmc LppA特异性抗体水平显著上升，并与进一步检测IL-4分泌水平的结果一致，由此推测IL-4的表达增多促进了特异性抗体的分泌，提示pVAX1-LppADNA疫苗可以引起体液免疫应答。综上所述，提示pVAX1-LppADNA疫苗可同时激发细胞和体液免疫应答以防御病原入侵。

攻毒保护效率也是检验疫苗免疫效果的重要指标，人工感染试验结果显示，小鼠接种pVAX1-LppADNA疫苗后刺激机体产生一定的免疫应答，Mmc感染小鼠后机体可特异性识别病原并快速清除，因此感染后不同试验组小鼠症状表现不一，所以疫苗免疫组小鼠临床症状和病理损伤明显减轻，发病数量减少，总体来看pVAX1-LppADNA疫苗剂量为100 μg的免疫效果最佳，略好于150 μg。一般来说免疫效果与疫苗剂量呈正相关，本研究结果中接种剂量100 μg效果却好于150 μg，可能的原因有几点：一是免疫的群体数量还不够大，结果存在一定的偏差；二是疫苗的剂量越高，对小鼠造成的不良反应和副作用也随之增大[22]。研究发现强大的免疫应答可以帮助机体抵御病原入侵减少损伤[23]，pVAX1-LppADNA疫苗激活的免疫应答水平不足以完全抵御侵染，未达到100%的保护率，但其引起高水平的特异性抗体也显示了LppA蛋白良好的免疫原性，疫苗的效果或许与免疫的程序、未使用佐剂等因素有关，对免疫途径、佐剂等进行优化期望pVAX1-LppADNA疫苗免疫能成为有效防控山羊支原体肺炎的方法。

4 结 论

Mmc脂蛋白LppA具有良好的免疫原性，重组质粒pVAX1-LppA能激活小鼠体内的免疫应答反应抵御Mmc感染，可作为防控羊支原体肺炎的候选疫苗。