MCM7在甲状腺乳头状癌组织中的表达及与survivin和P27蛋白的关系分析

张 鑫，肖 妮

(广东省佛山市第一人民医院病理科，广东 佛山 528000)

甲状腺乳头状腺癌是常见的甲状腺癌，恶性程度较低，但其发展缓慢，较为隐匿，易发生转移。甲状腺乳头状腺癌发病机制尚不清楚，细胞的异常增生及细胞凋亡机制与甲状腺乳头状腺癌的发生、发展密切相关[1]。微小染色体维持蛋白7(minichro-mosome maintenance protein7，MCM7)是DNA复制的起始关键因子，调控细胞周期，促进细胞分裂[2]，而P27蛋白属于细胞周期依赖性激酶抑制剂，具有负调控DNA复制的作用，两者共同调节细胞增殖，MCM7与P27异常表达均可导致细胞异常生长[3]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族一员，能抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂，有学者发现其在正常组织中几乎不表达，而在各种癌症组织中过表达，在癌症进展中发挥重要作用[4]。本研究分析了MCM7在不同甲状腺组织之间、甲状腺乳头状腺癌不同临床特征之间的表达情况及其诊断价值，并分析了MCM7与survivin、P27的相关性，探讨甲状腺乳头状腺癌的可能机制，为其诊断治疗提供理论支持。现报告如下。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 随机选取我院2019年1月—2021年3月因甲状腺疾病行外科手术切除的病理组织，其中甲状腺乳头状腺癌60例，甲状腺腺瘤40例，结节性甲状腺肿40例。另选取同期20例甲状腺正常的死亡尸体解剖的甲状腺组织。所有患者符合《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南》[5]中诊断标准。甲状腺乳头状腺癌患者男性11例，女性49例，年龄18～68岁，平均(40.12±8.36)岁。甲状腺腺瘤患者男性8例，女性32例，年龄19～66岁，平均(41.31±8.12)岁。结节性甲状腺肿患者男性9例，女性31例，年龄20～69岁，平均(42.52±7.85)岁。

本研究符合《赫尔辛基宣言》，所有患者或其家属均签署知情同意书。

1.2方法 免疫组织化学法检测甲状腺组织中MCM7、survivin、P27的表达：组织样本采用10%甲醛固定，经石蜡包埋，采用石蜡切片机(德国Leica Biosystems公司，Leica RM2125 RTS)连续切片。采用SP检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，SP0041)对切片进行染色，抗体使用兔抗人MCM7、survivin、P27一抗(美国abcam公司，ab52489、ab76424、ab32034)，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.3观察指标 结果评价标准[6]：于高倍镜(×400)下随机观察5个视野，每个视野取200个细胞计数，MCM7、P27蛋白阳性表达定位于细胞核，survivin阳性表达定位于细胞核及细胞质，呈黄色、棕黄色、褐色颗粒状。根据着色强度(无色：0分、淡黄色：1分、棕黄色：2分、褐色或黑色：3分)、阳性细胞比例(低于10%：1分、11%～50%之间：2分、51%～75%之间：3分、超过75%：4分)判断阳性表达情况，总分=着色强度得分×阳性细胞比例得分，总分3分及以上为阳性，3分以下为阴性。

1.4统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验；评估价值通过受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve，ROC曲线)评估，曲线下面积(area under curve，AUC)0.5～0.7时评估准确性低，0.7～0.9时有一定准确性，>0.9准确性较高。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同甲状腺组织中MCM7、survivin、P27的表达 不同甲状腺组织MCM7、survivin、P27表达比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；甲状腺乳头状癌MCM7阳性表达率为93.33%与甲状腺腺瘤的27.50%、结节性甲状腺肿的7.50%、正常甲状腺的0.00%比较，明显较高(P<0.05)。甲状腺乳头状癌survivin阳性表达率为96.67%与甲状腺腺瘤的37.50%、结节性甲状腺肿的15.00%、正常甲状腺的0.00%比较，明显较高(P<0.05)；甲状腺乳头状癌P27阳性表达率为21.67%与甲状腺腺瘤的100.00%、结节性甲状腺肿的100.00%、正常甲状腺的100.00%比较，明显较低(P<0.05)。见表1～2，图1。

表1 不同甲状腺组织中MCM7的表达Table 1 The expression of MCM7 in different thyroid tissues (例数，%)

表2 不同甲状腺组织中survivin、P27的表达Table 2 The expression of survivin and P27 in different thyroid tissues (例数，%)

图1 甲状腺乳头状癌组织MCM7、survivin、P27的免疫组织化学图(SP ×400)

A.甲状腺乳头状癌组织MCM7阳性；B.甲状腺乳头状癌组织survivin阳性；C.甲状腺乳头状癌组织P27阳性

Figure 1 Immunohistochemical plot of MCM7, survivin, and P27 in papillary thyroid carcinoma tissues(SP ×400)

2.2甲状腺乳头状腺癌组织MCM7、survivin、P27阳性表达单因素分析 不同性别、年龄的甲状腺乳头状腺癌组织之间MCM7阳性表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，肿瘤直径>1 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴结有转移的MCM7阳性表达率与肿瘤直径≤1 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ、淋巴结无转移比较，明显较高(P<0.05)；不同性别、年龄、肿瘤直径的甲状腺乳头状腺癌组织之间survivin阳性表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴结有转移的survivin阳性表达率与TNM分期Ⅰ～Ⅱ、淋巴结无转移比较，明显较高(P<0.05)；不同性别、年龄、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移的甲状腺乳头状腺癌组织之间P27阳性表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 甲状腺乳头状腺癌组织MCM7、survivin、P27阳性表达单因素分析Table 3 Univariate analysis of positive expression of MCM7, survivin and P27 in papillary thyroid adenocarcinoma tissue (例数，%)

2.3甲状腺乳头状腺癌组织MCM7与survivin、P27的相关性 甲状腺乳头状腺癌组织MCM7表达与survivin表达呈明显正相关(P<0.05)；甲状腺乳头状腺癌组织MCM7表达与P27表达呈明显负相关(P<0.05)。见表4。

2.4MCM7诊断甲状腺乳头状腺癌ROC分析 MCM7诊断甲状腺乳头状腺癌的AUC为0.942(95%CI：0.900～0.984，P<0.001)，诊断甲状腺乳头状腺癌准确性高。根据最佳临界值，当MCM7的cut-off值1.5时，约登指数为0.823，敏感度为93.3%，特异度为89.0%。见图2。

表4 甲状腺乳头状腺癌组织MCM7与survivin、P27的相关性Table 4 Correlation of MCM7 with survivin and P27 in papillary thyroid adenocarcinoma (例数)

图1 MCM7诊断甲状腺乳头状腺癌ROC曲线

3 讨 论

甲状腺癌是女性高发的头颈部恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状腺癌占80%～90%，发病率近年来呈升高趋势。目前临床主要采用实验室检查、超声影像、细胞病理学进行诊断，但诊断精准仍有一定难度及技术水平，需大量临床经验[7]。因此，探讨甲状腺乳头状腺癌简单易行的病理分子诊断指标具有重要价值。细胞周期异常引起的细胞过度增殖是肿瘤发生的基础，而细胞凋亡被抑制导致癌细胞死亡降低在肿瘤发展中起重要作用[8]。

细胞周期有四个时期，其中G1期为细胞分裂准备期，主要合成DNA复制所需的核苷酸，S期为DNA合成期，主要合成DNA、组蛋白及相关酶，G2期主要合成RNA及细胞骨架所需蛋白质[9]。DNA的复制、合成需要一个特定的复制起始点，G1早期MCM7与染色体上复制子结合参与形成复制前复合物，而在G1/S期MCM7被再活化，发挥DNA解链酶功能，最终启动DNA复制，延伸复制叉[10]。细胞周期中MCM7水平波动变化，G0期表达下降，S期从染色质上解离出来到达峰值，M期MCM7呈游离的微小染色体，而在细胞分化、凋亡时下降[11]。MCM7表达水平决定DNA复制能力，高MCM7水平能提高DNA复制速度，增加细胞增殖速度、生长能力。研究发现，甲状腺乳头状腺癌MCM7阳性表达率明显高于其他组织，说明甲状腺乳头状腺癌存在明显的细胞周期异常。肿瘤直径>1 cm的患者MCM7阳性表达较高，提示MCM7过表达促进癌细胞的生长，TNM分期Ⅲ～Ⅳ的患者阳性高表达，提示MCM7过表达促进甲状腺乳头状腺癌的发展，淋巴结有转移的患者MCM7阳性高表达，提示MCM7能促进甲状腺乳头状腺癌的浸润侵袭。

P27基因定位于12号染色体，属抑癌基因，高度保守性，基因突变概率小，P27作为负性调控因子参与细胞周期调控，主要通过抑制CDK4和CDK2的磷酸化抑制cyclin-CDK活性，限制细胞周期G1/S转换[12]。本研究发现P27在甲状腺乳头状腺癌组织中阳性表达明显较少，而正常组织中几乎均阳性表达，提示可能因P27蛋白需在胞核中才发挥细胞周期调节功能，甲状腺乳头状腺癌细胞可能通过将胞核内的P27蛋白泛素化降解减少或者向细胞质内转移抑制其负调控活性[13]。Survivin基因定位于17号染色体，通常以二聚体的形式存在，属于IAP家族，是一种细胞凋亡抑制蛋白，抑制活性明显强于Bcl家族成员，可激活SMAC、p21、受体、线粒体/细胞色素C等通路，直接作用于caspase家族，抑制细胞凋亡。Survivin还可同时调控细胞周期，与CDK结合激活cyclin-CDK加快G1/S期转换。Survivin正常生理下在G2/M期表达，参与调控细胞分裂过程中纺锤体的形成，抑制caspase水解纺锤体，维持有丝分裂持续进行，促进了细胞增殖，抑制细胞凋亡，余江涛等[14]通过沉默survivin基因能调节凋亡相关蛋白表达，促进甲状腺癌细胞凋亡。本研究发现甲状腺乳头状腺癌组织中survivin阳性表达明显高于其他组织，TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴结有转移的患者阳性表达明显较高，提示survivin与甲状腺乳头状腺癌发生、发展和转移密切相关。

本研究发现，MCM7与P27呈显著负相关，可能与P27基因的羧基末端结构域能与MCM7的保守结构域特异性结合，抑制MCM7，负调控细胞周期，确保细胞周期中DNA只复制一次，牛广旭等[15]发现在肝细胞癌中P27蛋白的表达下调，导致MCM7的表达上调，促进细胞周期异常增生。本研究还发现MCM7与survivin显著正相关，提示可能与survivin过表达抑制了细胞凋亡，使MCM7保持较高水平，促进细胞增殖，两者可能共同促进甲状腺乳头状腺癌的发生、发展。本研究通过ROC分析结果显示，MCM7诊断的AUC为0.942，具有较高的诊断价值，可以作为诊断甲状腺乳头状腺癌的病理分子标志物。

综上所述，甲状腺乳头状腺癌组织MCM7过表达，可能survivin过表达、P27蛋白低表达使MCM7保持高表达，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，共同参与甲状腺乳头状腺癌的发生、发展和转移。MCM7可用于鉴别诊断甲状腺乳头状腺癌，具有较高的准确性，可以作为诊断甲状腺乳头状腺癌的病理分子标志物。本研究不足之处在于研究结论仅限于临床理论基础，还需后续进一步细胞、动物实验的验证。