原花青素提高人舌癌细胞系放射敏感性及机制研究

刘菲菲，席照亮，刘秋月

作者单位：1首都医科大学附属北京友谊医院口腔科，北京 100050；

2民航总医院口腔科，北京 100025

舌癌是一种发病率非常高的癌症［1］，其中舌鳞状细胞癌是舌癌中最常见的类型，约占所有类型的80%，并以其高转移和增殖能力著称，通常会导致言语、咀嚼功能障碍，病死率很高［2-3］。对于舌鳞状细胞癌的治疗，目前多采用手术联合放化疗的方式，其中由于放射疗法的不断应用、进步和完善，其在早期及晚期舌癌的治疗中有着重要的作用［1，4］。但长时间的辐射暴露容易导致舌癌细胞出现辐射抗性，故对舌癌放疗增敏药物的开发成为了近些年研究的重点［5］。

原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSP）是植物中存在的一种富含酚羟基的物质，在葡萄籽提取物中，约90%的成分为GSP，易获取并且天然无毒［6］。目前相关的实验和临床研究表明，GSP 具有多种药理作用，例如有效的抗炎和抗氧化作用［6-8］。并且，越来越多的研究也发现GSP 能在一定程度上抑制癌细胞的增殖［9-10］，另外，也有研究发现，GSP用于肺癌细胞时，具有一定的放射增敏作用［11］。而本研究于2019 年3 月至2020 年2 月选取了体外培养的人舌鳞状细胞癌Tca8113 细胞，旨在探索GSP 对于Tca8113细胞放射敏感性的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂与仪器人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113购自中国科学院细胞研究所；GSP购自北京索莱宝科技有限公司（批号P7230）；DMEM 高糖细胞培养基、角质细胞无血清培养基采购自美国PAA公司，胎牛血清采购自美国Hyclone 公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annex‑in V-FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒均采购自美国BD 公司；RT-PCR 试剂盒采购自美国Ther‑mo 公司；BCA 试剂盒购自碧云天生物技术研究所；一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗均购自美国CST 公司；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）实验试剂盒采购自TaqMan 公司；细胞培养箱采购自美国Thermo 公司；6 MV X 线直线加速器采购自德国西门子公司；流式细胞仪采购自美国Beckman Coulter 公司；酶标仪采购自美国Gibco公司。

1.2 细胞培养以含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基在37 ℃、5%二氧化碳、饱和湿度的培养条件下培养人舌癌Tca8113细胞，每2天换1次液，3～4 d传1次代，取对数生长期细胞进行后续实验研究。

1.3 MTT 法将对数期生长的人舌癌Tca8113 细胞接种在96 孔板中，每4 000 个细胞/孔，每孔100µL 培养基，培养24 h。相关研究发现，当GSP 的浓度在20 mg/L 时，对细胞没有明显毒害作用，当超过20 mg/L 时，其毒性作用增加［12］，故分为Tca8113 细胞对照组（Tca CON），Tca8113 细胞加10 mg/L GSP组（Tca GSP-10 mg/L）、Tca8113 细胞加20 mg/L GSP组（Tca GSP-20 mg/L）、Tca8113 细胞照射组（Tca IR）、Tca8113 细胞照射加10 mg/L GSP 组（Tca IR+GSP-10 mg/L）、Tca8113 细胞照射加20 mg/L GSP 组（Tca IR+GSP-20 mg/L）。吸去培养基后，以排枪将100 µL 含有相应浓度GSP 的DMEM 高糖培养基加入各组96 孔板中，常规组（不需照射组）作用48 h，需照射的组别在加入对应的培养基作用24 h 后，即行照射（6 Gy），照射24 h 后，每孔加入5 g/L 的MTT溶液20 µL，继续培养4 h，去上清液，每孔加入150µL 的二甲基亚砜，使形成的结晶均匀溶解后，酶标仪562 nm 检测各浓度组吸光度，并计算细胞的生长抑制率，实验重复6次。

1.4 细胞凋亡实验将对数生长期的Tca8113细胞接种在96 孔板中（每孔1×105/mL），分组同MTT 法，在培养箱中培养24 h 后，加入含有相应浓度GSP 的培养基作用24 h，并以6 Gy 的剂量对需照射的组别进行照射，照后24 h 收集全部细胞于离心管内，常规组（不需照射组）作用48 h，收集全部细胞于离心管内，以1 000 r/min 离心5 min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤并离心2 次。随后，将500 µL 的Binding Buffer 悬浮细胞，5 µL Annexin V-FITC 和5 µL PI 染色溶液加入混匀后在避光条件下室温中反应15 min，通过流式细胞仪检测，并用其自带软件分析各组细胞凋亡率，实验重复6次。

1.5 qRT-PCR首先根据TaqMan miRNA ABC Purification 试剂盒的说明，在不同浓度GSP 培养的Tca8113 细胞中特异性提取微小RNA（miR）。分光光度计检测核酸浓度，以吸光度比A260nm/A280nm评估RNA 的纯度，并将评估合格的RNA 保存在−80 ℃。其次，以miR为模板，应用TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒进行RT-PCR 合成互补DNA（cDNA）。最后，以上一步合成的cDNA作为模板，利用TaqMan®Mi‑croRNA Assays 试剂盒进行qPCR 定量各组miR-124的含量。并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为miR-124 的内源对照，使用Allele ID 6.0 软件设计引物 ，miR-124 正 向 引 物 5′CUCCUCUGAAA‑CAGCUGCCUUA3′，反向引物：5′CCGUAAGUGGC‑GCACGGAAUCG3′；GAPDH 正向引物5′GTCT‑GCTCTGACTTCAACAGAG3′，反向引物：5′AC‑CAACCTGTCGCTGTAGCAAA3′，使用2−ΔΔCt方法计算基因表达相对量，实验重复6次。

1.6 蛋白质印迹法（Western blotting）将收集的细胞在蛋白裂解液中裂解30 min，超声后在4 ℃下以12 000 r/min 离心15 min。通过BCA 试剂盒定量蛋白浓度，使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的蛋白质，之后在4 ℃下进行300 mA 恒流转膜［聚偏二氟乙烯（PVDF）膜］。随后将膜在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，在4 ℃下用抗B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2），胱天蛋白酶-9（caspase-9），以及β 肌动蛋白（β-actin）的一抗过夜孵育，然后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG 二抗在室温下保持1 h，最后进行ECL 显影曝光检测，实验重复6次。

1.7 统计学方法采用±s进行计量数据表示，以Graph Pad Prism 6.0 软件进行相关统计；采用单因素方差分析进行多组间比较，当P<0.05 时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的GSP 对Tca8113 细胞抑制率的影响Tca CON 组、Tca GSP-10 mg/L 组及Tca GSP-20 mg/L 组Tca8113 细胞存活率分别为（98.51±3.96）%、（96.52±2.37）%、（95.89±3.65）%（F=0.65，P=0.555），表明人舌癌Tca8113 细胞生长增殖在加入GSP（10 mg/L GSP、20 mg/L GSP）作用后，其增殖抑制率没有明显差别，对细胞没有明显毒害作用，可用于后续实验。分组照射后，Tca IR 组、Tca IR+GSP-10 mg/L组及Tca IR+GSP-20 mg/L 组Tca8113 细胞存活率分别（63.21±2.97）%、（41.19±4.33）%及（19.61±2.51）%（F=126.30，P<0.001），GSP 加强了照射后对人舌癌Tca8113 细胞的抑制，且随药物浓度的增大，抑制效果增强（P<0.05），这说明GSP 对人舌癌Tca8113 细胞有放射增敏效果，且随药物剂量的增加，放射增敏效果增强。

2.2 GSP 提高了照射后引发的人舌癌Tca8113 细胞的凋亡通过Annexin-V/PI 双染法结合流式细胞术检测Tca8113 细胞在不同组别的凋亡水平变化。A、B、C 组为未照射组，细胞凋亡率分别为（5.57±1.02）%、（5.86±1.09）%、（6.22±1.14）%（F=0.54，P=0.593）；D、E、F 组为照射组，细胞凋亡率分别为（7.62±0.27）%、（9.61±0.42）%、（17.50±0.37）%（F=55.77，P=0.001），加入GSP 的E、F 组照射后细胞凋亡率明显大于单纯照射组D组（P<0.05）。该结果显示GSP 对人舌癌Tca8113 细胞具有明显的放射增敏作用，且随着药物剂量的增加，其放射增敏效果增强。

2.3 GSP 上调了Tca8113 细胞中miR-124 的表达水平通过qRT-PCR 检测在不同浓度GSP 作用下，照射后Tca IR 组、Tca IR+GSP-10 mg/L 组及Tca IR+GSP-20 mg/L组Tca8113细胞miR-124的表达水平分别（1.43±0.29）、（2.64±0.45）及（3.81±0.44）（F=26.54，P=0.001），与单纯照射组相比，照射（6 Gy）给药组（10 mg/L GSP，20 mg/L GSP）miR-124的表达水平明显上调（P<0.05）。

2.4 GSP 调节了Tca8113细胞中Bcl-2和caspase-9的表达水平Tca CON组、Tca GSP-10 mg/L组及Tca GSP-20 mg/L 组Tca8113 细胞中Bcl-2 及caspase-9 蛋白表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。与单纯照射组相比，照射（6 Gy）给药组（10 mg/L GSP，20 mg/L GSP），Bcl-2 表达明显下调（P<0.05），而caspase-9的表达明显上调（P<0.05），表明GSP 显著提高了IR诱导的Tca8113凋亡水平。见图1、表1。

表1 各组人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113中Bcl-2和caspase-9蛋白表达比较/± s

表1 各组人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113中Bcl-2和caspase-9蛋白表达比较/± s

注：Bcl-2为B细胞淋巴瘤-2，caspase-9为胱天蛋白酶-9。①与Tca IR组相比，P<0.05。

组别Tca CON Tca GSP-10 mg/L Tca GSP-20 mg/L F值P值Tca IR Tca IR+GSP-10 mg/L Tca IR+GSP-20 mg/L F值P值caspase-9 1.00±0.00 1.13±0.18 1.24±0.27 2.47 0.118 1.97±0.33 2.58±0.43①2.94±0.52①7.67 0.005重复次数666666 Bcl-2 1.00±0.00 0.92±0.14 0.87±0.16 1.71 0.213 0.77±0.25 0.43±0.23①0.31±0.17①7.10 0.006

图1 原花青素（GSP）调节了人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113中Bcl-2和caspase-9的蛋白表达（蛋白质印迹法）

3 讨论

本研究采用MTT 法研究了加入不同浓度GSP对照射后Tca8113 细胞活力的影响，结果显示，GSP对舌癌Tca8113 细胞具有良好的放射增敏效果，且药物浓度越高，其放射增敏效果越强。为初步探索其放射增敏效果的机制，我们采用流式细胞术结合Annexin V-PI 双染凋亡检测技术评价了加入不同浓度GSP 照射后的细胞凋亡率，发现其明显提高了Tca8113 的细胞凋亡水平；另外，qRT-PCR 结果表明GSP 显著上调了照射后Tca8113 细胞的miR-124 的表达水平，同时蛋白质印迹法结果显示，加入GSP照射后，Tca8113 细胞Bcl-2 表达水平明显下降，而caspase-9 的表达水平明显升高。初步显示GSP 对Tca813细胞的放疗增敏作用与miR-124的过表达及凋亡通路因子Bcl-2下调、caspase-9上调有关。

miR-124 作为中枢神经系统中含量最丰富的miR 之一而成为近年来的热点［13］。近年来也有研究指出miR-124 的异常表达与多种恶性肿瘤的发生、发展有关［14］。有研究报道，miR-124 可靶向作用于细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4、CDK6、细胞周期蛋白D2，从而抑制黑色素瘤的生长［15］；也有报道指出，miR-124 的过表达可减缓乳腺癌［16］、肺癌［17］、鼻咽癌［18］细胞的增殖；另外也有研究就miR-124 与胃癌之间的关系进行了报道，指出miR-124 可通过抑制胃癌中的EZH2 减缓癌细胞的增殖，并通过JNK的活化移至线粒体的周围，进而抑制了Bcl-2 的表达，从而促进了癌细胞的凋亡［19］；更有研究指出，miR-124 的过表达可提高结直肠癌的放射敏感性［20］。本研究的结果中，加入GSP 照射后，miR-124上调明显，Tca8113 细胞增殖受到抑制，并且凋亡通路因子Bcl-2 表达下降，凋亡起始蛋白caspase-9 表达上调，加强了癌细胞的凋亡水平，从而进一步提高了其放射敏感性。

GSP 是植物中广泛存在的一类多酚类化合物，是目前国际上公认的清除人体内自由基高效的天然抗氧化剂，具有很强的体内活性［21］。相关研究表明，GSP 的抗自由基氧化能力是维生素E 的50 倍，是维生素C 的20 倍，并且吸收迅速完全，代谢半衰期可达7 h 之久［22］。目前，多种动物实验和实验系统研究的结果说明，GSP 无毒、无致突变性、无致癌性、无致畸胎性、无致敏性［23-25］，并且本研究实验结果显示GSP 对舌癌细胞具有良好的放射增敏效果，这使其在成品放疗增敏药物的研发上具有较大的优势和潜力。