化胃舒颗粒中红参的皂苷类成分含量测定方法及其降解产物研究

辛旭阳，邹桂欣，赵玥，刘晶，尤献民，马跃海（辽宁省中医药研究院，沈阳 110034）

化胃舒颗粒由红参、白术、茯苓、当归、甘草、乌梅、半夏、陈皮、黄芪等药材组成，具有降逆止呕、益气健脾等功效，用于缓解癌症患者化疗引起的食欲不振、恶心等不良反应。红参为处方中君药，所含人参皂苷Rg、Re、Rb等人参皂苷有耐缺氧、抗疲劳、提高机体免疫功能等药理作用，是与化胃舒颗粒质量密切相关的一类化学成分。但研究中发现，在化胃舒颗粒中没有检测到人参皂苷Rg、Re、Rb等成分，分析有可能在提取过程中发生了降解。已有文献资料报道，人参皂苷Rg、Re、Rb等成分易受温度、pH 值等因素的影响而发生降解等化学反应，在酸性条件下会降解成不同的次级苷，包括抗肿瘤活性较强的人参皂苷Rg、Rh等，其具有抑制肿瘤细胞的黏附、浸润、增殖以及抗肿瘤新生血管形成作用，因此探讨化胃舒颗粒中人参皂苷Rg、Re、Rb降解的原因及是否生成了具有活性的降解产物人参皂苷Rg和 Rh，对保证化胃舒颗粒的疗效具有重要意义。

红参中的人参皂苷成分与其他药材配伍时，在提取、浓缩及干燥过程中会发生变化，化胃舒颗粒是由多种中药药材组成的复方制剂，包括当归和酸性较强的乌梅等。前期研究结果提示，处方中黄芪、陈皮、玄参、甘草及乌梅等药材会对化胃舒颗粒中人参皂苷Rg、Re、Rb含量有影响，本试验通过比较红参煎液、化胃舒全方液、红参与乌梅共煎液及去除乌梅的全方共煎液等4种煎液中，人参皂苷Rg、Re、Rb、Rg、Rh的含量变化，以期为化胃舒颗粒中药效物质基础成分的测定及质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；色谱工作站（Agilent Chemstation 工作站）；DAD 二极管阵列检测器；FA1004 电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）；KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

人参皂苷Rg（批号：111730-201027），Re（批 号：110754-200822），Rb（批 号：110704-201122），Rh（批 号：111748-200501），Rg（批号：110804-200603）（供含量测定用，中国食品药品检定研究院）。红参、白术、茯苓、当归、甘草、乌梅、半夏、陈皮、黄芪（亳州市星跃药业有限责任公司，符合《药品经营质量管理规范》要求）。甲醇、乙腈为色谱纯（安徽天地高纯溶剂有限公司），水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 人参皂苷Rg1、Re及Rb1的含量测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱 C（Synergiolar-Rp，250 mm×4.6 mm，4 μm），柱温为30℃，流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗 脱（0～10 min，0%～3%A；10～20 min，3%～10%A；20～25 min，10%～33%A；25～30 min，33%～50%A；30～35 min，50%～80%A；35～37 min，80%～83%A）；流速为1.0 mL·min；检测波长为203 nm；进样量为10～20 μL。人参皂苷对照品混合溶液及红参供试品溶液典型HPLC图见图1。

图1 混合对照品（A）、红参供试品溶液（B）的HPLC图Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference substance（A）and red ginseng sample（B）

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg、Re及Rb对照品各适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每 1 mL各含Rg、Re、Rb为 2.047、1.855、2.589 mg的混合对照品储备溶液，备用。

2.1.3 红参水煎溶液的制备 取红参药材80 g（破碎），置2000 mL圆底烧瓶中，加入8倍量（6400 mL）水，加热回流提取4 h，滤过，放冷后，备用。

2.1.4 供试品溶液的制备 精密量取红参水煎溶液适量，加水稀释至100 mL，摇匀，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗2次，每次50 mL，续用正丁醇饱和水洗1次，正丁醇液蒸干，残渣用适量水溶解，上样于预处理的D大孔吸附树脂柱（20 cm×1.5 cm）上，用4 BV的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，再用5 BV的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为红参供试品溶液（折合红参生药量0.2 g·mL）。

2.1.5 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取各溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，以对照品进样量（

X

）为横坐标，相应各峰面积（

Y

）为纵坐标绘制标准曲线，并计算回归方程，结果

Y

＝252.3

X

＋2.510，

r

＝0.9994，线性范围0.4094～10.24 μg；

Y

＝317.3

X

＋94.68，

r

＝0.9993，线性范围0.3710～9.125 μg；

Y

＝421.1

X

＋125.6，

r

＝0.9995，线性范围0.5178～12.95 μg，各成分在范围内与峰面积线性关系良好。2.1.6 精密度试验 取红参水煎溶液适量，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件平行进样6次，测定人参皂苷Rg、Re和Rb峰面积，计算

RSD

分别为 1.2%、2.0%和1.1%，表明方法的精密度良好。2.1.7 稳定性试验 精密吸取“2.1.6”项下供试品溶液，分别于室温放置 0、2、4、8、12、24 h时进样，测定人参皂苷Rg、Re和Rb峰面积，计算

RSD

分别为 2.0%、1.8%、1.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.1.8 重复性试验 精密量取红参提取液适量，平行6份，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算人参皂苷Rg、Re和Rb含量分别为131.2、50.17、237.1 mg·g，

RSD

分别为1.0%、1.3%、1.9%，表明方法重复性良好。2.1.9 加样回收试验 精密量取红参水煎溶液适量，平行6份，精密加入人参皂苷Rg、Re、Rb对照品溶液适量，再加水至约100 mL，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算人参皂苷Rg、Re、Rb回收率及

RSD

，结果见表1，表明方法的加样回收率良好。

表1 人参皂苷Rg、Re和Rb加样回收试验
Tab 1 Recovery of ginsenosides Rg，Re and Rb

化合物 样品中原含量/mg 检出量/mg 加入量/mg 检出总量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%人参皂苷Rg1 0.6629 0.6826 0.6987 1.3455 97.70 97.92 0.72 0.6629 0.6782 0.6987 1.3411 97.07 0.6629 0.6789 0.6987 1.3418 97.17 0.6629 0.6877 0.6987 1.3506 98.43 0.6629 0.6872 0.6987 1.3501 98.35 0.6629 0.6902 0.6987 1.3531 98.78人参皂苷Re 0.2535 0.2590 0.2683 0.5125 96.53 96.56 0.65 0.2535 0.2602 0.2683 0.5137 96.98 0.2535 0.2562 0.2683 0.5097 95.49 0.2535 0.2610 0.2683 0.5145 97.28 0.2535 0.2598 0.2683 0.5133 96.83 0.2535 0.2583 0.2683 0.5118 96.27人参皂苷Rb1 1.1980 1.1582 1.2108 2.3562 95.66 95.84 0.31 1.1980 1.1621 1.2108 2.3601 95.98 1.1980 1.1569 1.2108 2.3549 95.55 1.1980 1.1642 1.2108 2.3622 96.15 1.1980 1.1567 1.2108 2.3547 95.53 1.1980 1.1647 1.2108 2.3627 96.19

2.2 人参皂苷Rh2、Rg3含量测定方法

2.2.1 色谱条件 Kromail C色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流 动 相A为 乙 腈，B为0.05% 磷酸水溶液，梯度洗脱（0～40 min，40%～60%A；40～50 min，60%～100%A），流速为1.0 mL·min，柱温为30℃，检测波长为203 nm，进样量为20～50 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg及Rh对照品各适量，分别置5 mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，备用；分别精密量取上述各溶液2 mL，置同一5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1 mL各含人参皂苷Rg、Rh为1.050 mg、1.194 mg 的混合对照品溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 取样品液100 mL，用水饱和正丁醇提取6次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容于5 mL量瓶中，摇匀，备用。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8及1.6 mL，分别置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取各溶液20 μL，进样测定，以对照品进样量（

X

）为横坐标，相应峰面积（

Y

）为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。结果

Y

＝1497

X

＋51.42，

r

＝0.9998，线性范围为0.4200～6.72 μg；

Y

＝1957

X

＋22.21，

r

＝0.9999，线性范围为0.478～7.642 μg。

2.3 化胃舒颗粒中红参中苷类成分降解研究

2.3.1 研究思路 研究思路见图2。

图2 红参中皂苷的降解研究思路Fig 2 Research ideas on the degradation of ginsenoside

2.3.2 样品溶液的制备 红参单煎液制备参见“2.1.3”项下方法。

① 全处方共煎液：按处方称取相当于红参80 g处方量的所有药材适量，加入8倍量水，回流提取4 h，滤过，放冷后，取滤液，备用。

② 红参配乌梅共煎液：取红参80 g，乌梅片165 g，加水8倍量，回流提取4 h，滤过，放冷，取滤液，备用。

③ 去除乌梅外红参与其他药材共煎液：除乌梅药材外，按处方取相当于红参80 g处方量的其他药材，加入8倍量水，回流提取4 h，滤过，放冷后，取滤液，备用。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取“2.3.2”项下各溶液适量，置分液漏斗中，按“2.1.3”项下方法制备人参皂苷Rg、Re、Rb供试品溶液，按“2.2.3”项下方法制备人参皂苷Rg、Rh供试品溶液，滤过，备用。

2.3.4 测定方法与结果 分别吸取对照品、供试品溶液及加标样品溶液20～50 μL，注入液相色谱仪中，分别按“2.1.1”及“2.2.1”项下色谱条件测定，计算相当于每100 g红参药材中人参皂苷Rg、Re、Rb及Rg、Rh含量，结果见表2，其典型HPLC色谱图见图3～4。

图3 化胃舒颗粒中人参皂苷类成分的HPLC图Fig 3 HPLC of ginsenosides in aqueous extract of Huaweishu A.人参皂苷Rg1、Re对照品（ginsenosides Rg1 and Re reference）；B.人参皂苷Rb1对照品（ginsenosides Rb1 reference）；C.全 处方共煎液（aqueous extract of Huaweishu）；D.红参配乌梅共煎液（aqueous extract of red ginseng with smoked plum）；E.去除乌梅共煎液（Huaweishu without smoked plum）；1. 人参皂苷Rg1（ginsenosides Rg1）；2.人参皂苷Re（ginsenosides Re）；3.人参皂苷Rb1（ginsenosides Rb1）

从表2可知，红参提取液中人参皂苷Rg、Re和Rb的含量分别为134.2、54.88和234.3 mg，而在化胃舒全处方提取液中人参皂苷Rg和Re没有被检测到，Rb的含量也下降约75%；红参与乌梅共煎液中未检测到人参皂苷Rg、Re和Rb；而在缺乌梅的化胃舒处方中可以检出人参皂苷Rg、Re和Rb，只是含量有所降低。在4种煎提液中，经加标样品验证，均未检测到人参皂苷Rg和Rh。

表2 不同煎提液中人参皂苷的含量(mg)
Tab 2 Contents of ginsenoside in different extracts (mg)

煎提液 Rg1 Re Rb1 Rg3 Rh2红参单煎液 134.2 54.88 234.3 － －全处方共煎液 － － 58.52 － －红参与乌梅共煎液 － － － － －去除乌梅外红参与其他药材共煎液 40.58 41.29 120.8 － －

3 讨论

3.1 检测波长的确定

在2020年版《中国药典》一部红参饮片项下，人参皂苷Rg、Re、Rb的检测波长为203 nm，没有人参皂苷Rg及Rh的测定波长，在本试验中曾对这5种待测成分的对照品溶液进行在线紫外扫描，结果均为末端吸收，结果5种成分的吸收曲线相似，因此参考人参皂苷Rg、Re、Rb检测波长，将人参皂苷Rg及Rh的测定波长确定为203 nm。

图4 人参皂苷Rg3对照品（A）、人参皂苷Rh2对照品（B）、全处方共煎液（C）的HPLC图Fig 4 HPLC of ginsenosides Rg3（A），ginsenosides Rh2（B）and aqueous extract of Huaweishu（C）

3.2 乌梅对化胃舒中人参皂苷的影响

从表2可知，在化胃舒全处方共煎液中，人参皂苷Rg，Re没有检测到，人参皂苷Rb含量显著降低，可能是由于这3种成分被降解。有文献报道在特定的化学环境或生物环境下，常见人参皂苷的糖苷键可发生断裂，降解为稀有人参皂苷Rh及Rg等。人参皂苷Rh属于人参二醇型单糖皂苷，人参皂苷Rg属于人参二醇型双糖皂苷，在醋酸溶液酸性条件下，二醇组人参皂苷在提取过程中发生降解，可以获得人参皂苷Rg，另外人参皂苷Rb发生水解可以转化为20

R

和20

S

-人参皂苷Rg，Rb和Rg，二者呈现明显的互为消长关系。乌梅中含有丰富的有机酸，其水煎液pH值在2.7左右，本研究中，红参与乌梅配伍提取时，人参皂苷Rg、Re和Rb的含量均未检出，提示处方中乌梅药材所含酸性化合物可将人参皂苷水解，缺乌梅的化胃舒药材配伍共煎液中可检测到人参皂苷Rg、Re、Rb含量也证实了这一结果，在去除乌梅后，共煎液中人参皂苷Rg、Re和Rb都能检出，只是含量有所降低，这也说明在化胃舒的处方中可能还存在其他成分，影响人参皂苷Rg、Re和Rb的含量。

3.3 人参皂苷Rg3、Rh2测定方法优化及峰确认

由于人参皂苷Rg、Rh在红参中的含量很低，复杂的处理过程会使其收率损失较大，因此供试品溶液制备中直接用正丁醇提取的方法，与其他杂质成分的分离在色谱条件优化中解决，试验中对人参皂苷Rg、Rh进行了多种色谱条件试验，并进行加标验证及在线紫外光谱扫描以保证测定结果的准确性，结果表明在人参皂苷Rg与Rh保留时间附近有其他色谱峰，但都不是人参皂苷Rg与Rh。

3.4 小结

本文建立了化胃舒颗粒中红参与不同药材配伍共煎液中人参皂苷Rg、Re、Rb、Rg和Rh的HPLC色谱方法，测定了上述人参皂苷成分与化胃舒颗粒中不同药材配伍时的含量，并对化胃舒颗粒中未检出人参皂苷Rg、Re、Rb成分的原因进行了推测和验证，提出乌梅药材是降低人参皂苷Rg、Re、Rb含量的主要因素，处方中其他药材也有一定的影响；初步推断人参皂苷Rg、Re、Rb发生了降解，但并没有降解为稀有人参皂苷Rg和Rh，由于人参皂苷水解的过程受多种因素影响，产物复杂，进一步的研究还在进行中。