Ti3C2Tx-CaCO3复合膜的构建及其成骨活性研究

高雨洁

（成都医学院第一附属医院，四川成都 610500）

骨缺损是口腔种植领域始终面临的一大困境。诸多长期缺牙患者或者外伤患者常常面临骨高度或骨宽度不足的情况，骨量不足限制了种植修复的美学与功能恢复，且不利于种植材料的长期稳定性。为了解决骨量不足的问题，临床上最常见的解决方式是进行GBR骨增量手术，其原理是在骨缺损区域放置骨再生材料，随后在软硬组织之间放置屏障膜并关闭软组织切口。屏障膜作为骨再生领域常用的生物材料，具备阻隔软组织并维持成骨空间的能力。理想的屏障膜还应具备促进成骨分化的功能，提升骨缺损区域实际成骨效果。

在诸多生物材料中，Ti3C2Tx是一类新型二维纳米材料，具有高比表面积及活性基团，包含多种过渡金属碳化物、氮化物及金属导电性碳氮化物，具有亲水性和良好的机械性能，在生物工程领域逐渐受到研究者的关注[1]。还有一种经典的化合物引起了研究者的注意，CaCO3中的钙元素是天然骨组织中的重要组分，由于具有良好的生物活性、生物相容性、骨传导性和高表面活性，已经被广泛应用于骨组织工程生物材料领域[2]。因此，本研究探索Ti3C2Tx与CaCO3共同构建一类新型屏障膜，兼备机械强度与成骨活性，既可以阻止软组织侵入成骨空间，还可诱导骨缺损区域前成骨细胞的成骨分化，提升骨增量手术的可预期性，增加成骨速度及成骨效率。

本实验构建了Ti3C2Tx-CaCO3复合膜，通过扫描电子显微镜观测微观形貌，并进行细胞学实验检测细胞增殖率及碱性磷酸酶活性，分析该材料的生物相容性与成骨活性，探究Ti3C2Tx-CaCO3复合膜在骨再生生物工程领域的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

Ti3AlC2，98%，吉林11科技有限公司；氟化锂，98%，Sigma；37%浓盐酸和氯化钙，分析纯，国药集团；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液，Gibco公司；EdU细胞增殖检测试剂盒、Hoechst 33342染色剂、RIPA裂解液、碱性磷酸酶试剂盒和BCA蛋白试剂盒，碧云天生物技术有限公司；4%多聚甲醛，Biosharp公司；Triton X100、地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸，Sigma公司。

1.2 实验设备

GM-0.33A型真空抽滤泵，天津津腾实验设备有限公司；RCTbasic型恒温磁力搅拌器，德国IKA公司；Micro17R型台式高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司；5702型台式低速离心机，德国艾本德公司；ME54T/02型电子分析天平，梅特勒托利多公司；Milli-Q型超纯水机，德国默克公司；SU6200型扫描电子显微镜，日本日立有限公司；Varioskan LUX型酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 Ti3C2Tx-CaCO3的制备

将0.8 g氟化锂与20 mL盐酸（9 mol/L）混合于聚四氟乙烯瓶中，加入1 g的Ti3AlC2粉末，使用恒温磁力搅拌器，使混合液在35 ℃连续反应48 h。将反应液放入离心机中，使用去离子水多次离心洗涤（3 500 r/min，每次15 min），直至上清液pH＞6，收集黑色沉淀层（Ti3C2Tx）并重悬于去离子水中。加入CaCl2，使用磁力搅拌器混合均匀，使Ca2+结合于Ti3C2Tx片层表面。向混合液内通入CO2，得到Ti3C2Tx-CaCO3混合分散液。使用真空过滤设备抽滤得到Ti3C2Tx-CaCO3复合膜。放入真空干燥罐中自然干燥24 h，复合膜可从滤膜表面揭下。

1.3.2 Ti3C2Tx-CaCO3的表征

Ti3C2Tx-CaCO3复合膜的表面和横截面形貌采用扫描电子显微镜（SEM）进行观察。将复合膜裁剪成适当大小，充分干燥，喷金后使用扫描电镜进行表面微观形貌观察。将复合膜进行液氮脆断处理，保持横截面完整性，充分干燥，喷金后使用扫描电镜进行横截面微观形貌观察。

1.3.3 生物相容性检测

将小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1以细胞密度1×104个/孔分别接种于细胞爬片及复合膜上，在温度为37 ℃，5% CO2的环境下培养24 h。随后将细胞和EdU共培养2 h。使用4%多聚甲醛室温固定15 min。 使 用 0.1% Triton X-100 通 透 15 min。 通过30 min的点击反应使EdU标记荧光染料。使用Hoechst 33342染色细胞核。将样本放置在荧光显微镜下进行观察。每组随机选取5个区域，统计EdU阳性（呈绿色）的细胞数量和总细胞数量（呈蓝色），EdU阳性率=EdU阳性细胞数/总细胞数，计算细胞增殖率。

1.3.4 成骨活性检测

将小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1以细胞密度为1×104个/孔分别接种于细胞爬片及复合膜上，在温度为37 ℃，5% CO2伴成骨诱导液的环境下分别培养4天和7天。到相应时间节点后，吸去培养基并加入RAPI裂解液，以15 000×g离心12 min以收取总蛋白。首先使用碱性磷酸酶试剂盒，与样本反应后使用酶标仪测定405 nm处吸光度。接着使用BCA蛋白检测试剂盒，使用酶标仪测定562 nm处吸光度，定量样品蛋白总量。最终根据酶活性的定义，计算得到碱性磷酸酶活性值。

1.3.5 统计分析

使用Graphpad Prism软件对数据进行分析及作图处理。开展正态性与方差齐性检验，组间比较使用单因素方差分析。所有实验均重复三次，数据以均数±标准差表示。P＜0.05表示差异具有统计学意义，其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，****表示P＜0.0001。

2 结果与分析

2.1 材料的制备与表征

如图1所示，最终得到的复合膜材料呈完整膜片状，整体外观灰黑色，复合膜的伸展性及柔韧性均较良好。使用扫描电子显微镜对复合膜表面及横截面进行微观观察，可见表面主要为数百纳米的二维片层Ti3C2Tx纳米片堆叠，横截面由球状CaCO3穿插于Ti3C2Tx片层结构之间，共同构成统一整体。其中，CaCO3微球在片层表面及片层之间分布均匀，大小亦相对均一。研究显示，Ti3C2Tx表面存在多个可负载其他物质的锚定位点。该复合杂化材料结构稳定，在生物医药领域具备应用潜力。

图1 Ti3C2Tx-CaCO3复合膜外观形貌图

2.2 材料的生物相容性

通过EdU试剂盒检测小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1与复合膜材料共培养后的细胞增殖能力，评价Ti3C2Tx-CaCO3复合膜的生物相容性，对于指导该材料的应用前景具有基础意义。由图2可知，复合膜组的细胞具有更高的细胞增殖活性，提示该复合膜材料具有促进细胞增殖的作用。这是由于Ti3C2Tx的组成元素主要为C与Ti，C元素是生物有机体中不可或缺的元素成分，而Ti对生物有机体呈现相对惰性的状态，这意味着Ti3C2Tx在生物体内相对稳定[3]。而CaCO3早已作为补钙剂的成分之一应用于临床，同样具有良好的生物相容性。实验结果证实该材料整体无明显细胞毒性，是生物材料实际应用的重要前提。

图2 Ti3C2Tx-CaCO3复合膜促细胞增殖活性

总体而言，Ti3C2Tx-CaCO3复合膜具有良好的生物相容性，并具备促进小鼠前成骨细胞增殖的能力，这一结果提示该材料具备在骨再生领域应用的潜力和价值。

2.3 材料的成骨活性

通过碱性磷酸酶试剂盒检测Ti3C2Tx-CaCO3复合膜对小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1的诱导成骨能力，分析该材料在骨再生组织工程领域的应用潜力。如图3所示，与对照组相比，复合膜组在第4天和第7天的碱性磷酸酶活性均有显著提高。

图3 Ti3C2Tx-CaCO3复合膜成骨活性

碱性磷酸酶（ALP）是硬组织的重要组成成分，也是细胞成骨分化的标志物。实验证明Ti3C2Tx-CaCO3复合膜具有明确的促进成骨分化功能，这与Ti3C2Tx表面具有丰富锚定位点以便于附着成骨诱导液中相关物质有关[4]，也与CaCO3固有的成骨刺激途径相关[5]。这一结果确定了该材料的成骨活性，意味着使用该材料作为屏障膜不仅可以起到屏障隔离作用以防止软组织长入，还可以促进骨组织的快速形成，利于骨缺损区域的恢复，具有极高的应用价值。

3 结论

本实验所构建的Ti3C2Tx-CaCO3复合膜由Ti3C2Tx纳米片夹层球状CaCO3所构成，具有良好的生物相容性，可显著促进细胞增殖。此外，该材料可提高碱性磷酸酶活性，具有促进成骨分化的能力，是可应用于骨再生工程的新型生物材料。